Yeast Total RNA Mini Kit

酵母總 RNA 快速提取試劑盒

酵母總RNA提取試劑盒

目錄號：91110

產品內容

自備試劑

無水乙醇、β-巰基乙醇

產品簡介

適用于從酵母樣本中提取總RNA，提取的RNA可直接用于RT，RT-PCR，RT-qPCR，普通轉錄組測序、RACE等。

產品特點

1. 高質：28s/18s=2:1，OD260/280=2.0～2.2！

2. 高效：提取全過程僅需 30 min！

操作步驟

① 第一次使用前，請先在漂洗液 RW，詳見瓶身的標簽。

②操作前，在裂解液 RLT 中加入 1% 的 β-巰基乙醇，例如 1ml RLT 中加入10 μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的 RLT 可在 4℃放 30 天。

③吸取使用量的緩沖液 SE 加入β-巰基乙醇至終濃度 0.2%，備用。

提示：所有離心步驟必須在室溫（15~25℃）下進行。

1. 小量酵母培養細胞：

a．收集 1 ml（約 107細胞）處于對數生長期酵母培養物到 1.5 ml 離心管，12,000 rpm 離心30sec，盡可能吸棄上清。

b．加入100μl緩沖液SE中（確認已經加入 0.2% β-巰基乙醇），輕柔吹打充分重懸細胞；根據酵母量加入約 20 μl Lytic Enzyme 儲液，充分顛倒混勻，37℃溫育 15~30 min 消化細胞壁，中間可顛倒數次幫助消化。

注意：如果破壁效果不好導致產量低，可以加大 lytic Enzyme 用量來提高酶工作濃度，還可以延長消化時間或者提高溫度到 45℃來提高效果，不適合 Lytic Enzyme 消化的酵母可選用其它方法如0.5mm 玻璃珠渦旋擊打 ，反復凍融等。

c．加入 380 μl 裂解液 RLT（確認已加入 1% β-巰基乙醇），吹打混勻后用手劇烈振蕩 20 sec，充分裂解。

注意：一般加入裂解液后充分渦旋吹打后應該見不到明顯團塊或者不溶物,極少數情況下如果有明顯團塊或者不溶物可以將裂解物13,000rpm 離心 3 min,沉淀不能裂解的碎片或者不溶物, 將裂解物上清全部轉到一個新離心管再進行下一步。

d．加入 280 μl 無水 乙醇，立即吹打混勻，不要離心。

e．下接步驟 3。

2. 中量酵母培養細胞：

a． 收集 2~3 ml（約 3X107 細胞）處于對數生長期酵母培養物到 1.5 ml離心管（超過 1.5 ml 可分兩次在同一個離心管內進行收集細胞），12，000rpm 離心30 sec，盡可能吸棄上清。

b． 加入300 μl緩沖液SE中（確認已經加入β-巰基乙醇至終濃度0.2%），輕柔吹打充分重懸細胞；根據酵母量加入 50μl Lytic Enzyme 儲液，充分顛倒混勻，37℃溫育 15~30 min 消化細胞壁，中間可顛倒數次幫助消化。

注意：如果破壁效果不好導致產量低，可以加大 lytic Enzyme 用量來提高酶工作濃度，還可以延長消化時間或者提高溫度到 45℃來提高效果，不適合Lytic Enzyme消化的酵母可選用其它方法如0.5mm玻璃珠渦旋擊打 ，反復凍融等。

c． 13,000 rpm 離心 1 min，盡可能吸棄上清。

d． 加入350μl裂解液RLT（確認已經加入 β-巰基乙醇至終濃度 1%），吹打混勻后用手劇烈振蕩20sec，充分裂解。

注意：一般加入裂解液、充分渦旋吹打后，應該見不到明顯團塊或者不溶物。極少數情況下，如果有明顯團塊或者不溶物，可以將裂解物13,000 rpm 離心 3 min，沉淀不能裂解的碎片或者不溶物, 將裂解物上清全部轉到一個新離心管再進行下一步。

e． 加入等體積 70％乙醇（DEPC 水配制，約 350μl）立即吹打混勻。

f． 下接步驟 3。

3. 將≤750μl 上清混合液加入 RNA 吸附柱中，13,000 rpm 離心 1 min，倒棄濾液。此時，RNA 被吸附在膜上。重復此過程，直到溶液全部上柱。

4. 加入 700 μl 去蛋白液 RW1，室溫放置 1min，13,000 rpm 離心 30 sec，倒棄濾液。

5. 加入 500μl 漂洗液 RW，13,000 rpm 離心 30 sec，倒棄濾液。

6. 重復步驟 5 一次。

7. 將 RNA 吸附柱放回空收集管中，13,000 rpm 離心 2 min，除去乙醇。

8. 取出 RNA 吸附柱，放入 RNase-free1.5 ml 離心管中，向 RNA 吸附膜的中央部位懸空滴加30-50μl RNase-free H2O，室溫放置 1 min，13,000 rpm 離心 1 min。

9. 提取的總 RNA，可直接用于下游實驗，或于-70℃保存，以免降解。

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