無內毒素質粒小提中量試劑盒可提取 5-15ml 菌液，采用改進的 SDS-堿裂解法裂解細胞，通過du特的內毒素清除劑選擇性結合離心除去內毒素，然后離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低 pH 值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒 DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質粒 DNA 從硅基質膜上洗脫。
無內毒素質粒小提中量提取試劑盒 核酸提取

EndoFree Plasmid Midi Kit

無內毒素質粒小提中量快速提試劑盒

無內毒素質粒小提中量提取試劑盒 核酸提取

目錄號：31110

產品內容:

保存條件:

在室溫(15 ~ 25℃)干燥條件下，可保存 12 個月。

RNase  A、內毒素清除劑，可常溫運輸，-20℃保存。

產品簡介：

無內毒素質粒小提中量試劑盒可提取 5-15ml 菌液，采用改進的 SDS-堿裂解法裂解細胞，通過du特的內毒素清除劑選擇性結合離心除去內毒素，然后離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低 pH 值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒 DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質粒 DNA 從硅基質膜上洗脫。所得質粒可直接用于酶切、轉化、PCR、RT-qPCR、測序及轉染等分子生物學實驗。

產品特點:

1. du特工藝配方清除內毒素，內毒素含量極低（<0.1 EU/ug DNA），細胞轉染效果ji佳。

2. 得率高： 5 – 15 ml 菌液可提出多達 30 – 90 ug 的純凈質粒。

重要提示：

一、使用前請先檢查平衡液、溶液 P2 和溶液 N3 是否出現渾濁，如有混濁現象，可在 37℃

水浴中加熱幾分鐘，即可恢復澄清。

二、shou次使用前請先在去蛋白液 PE、漂洗液 WB 中加入無水乙醇（詳見瓶身的標簽），混勻。

三、shou次使用時請先將 RNase A 全部加到溶液 P1 中，混勻，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。

操作步驟：

1. 柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入 100 ul 的平衡液，12,000 rpm 離心 1 min，棄收集管中濾液，將吸附柱重新放回收集管中。

2. 取 5 ~ 15 ml 過夜培養的菌液，室溫 9,000 rpm 離心 2 min，盡量倒干上清，收集菌體。

（注意：根據菌液的濃度決定取液量，濃度高時取 5 ml 菌液離心即可，濃度低時可多收集一次）

3. 加入 500 ul 溶液P1，重懸菌體沉淀，渦旋震蕩至che底懸浮。

（注意：如有未che底懸浮的菌塊會影響裂解，導致提取的質粒濃度及純度降低）

4. 加入 500 ul 溶液P2，溫和地上下翻轉 6-8 次，使菌體充分裂解，室溫放置 4 min。

（注意：不可劇烈震蕩，以免造成基因組 DNA 片段的污染，所用時間不要超過 5 min，以免質粒受到破壞，如未wan全變得清亮，可能是菌體太多，可增加溶液 P2 的用量，在后續的操作中溶液 P3 的用量也要相應增加）

5. 加入 500 ul 溶液 N3，立即溫和地上下翻轉 6-8 次，充分混勻時會出現白色絮狀沉淀，

然后室溫 13,000 rpm 離心 10 min，小心取上清至新管，避免吸到白色漂浮物。

（注意：加入溶液 P3 后應立即混合，避免產生 SDS 的局部沉淀）

6. 加入 0.1 體積 (上清的體積的 10%，約 160 ul ) 的內毒素清除劑到上一步所得上清，顛倒旋轉混勻，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷凍室)放置 5 分鐘，直到渾濁變清亮透明（或仍舊稍有渾濁），中間偶爾混勻幾次。

（注意：內毒素清除劑加入上清后，上清會變得渾濁，但是冰浴后應恢復清亮,或稍渾濁。）

7. 常溫放置 3 ~ 5 分鐘，溫度恢復室溫溶液很快變為渾濁，顛倒混勻。（37℃可加速渾濁）

8. 室溫 15,000 rpm 離心 10 分鐘分相 。上層水相含 DNA，下層藍色油狀相含內毒素和其它雜質。將含 DNA 的上層水相轉移到新管（注意不要吸到藍色油狀層，里面含內毒素等雜質），棄油狀層。

9. 向上層水相中加入 0.5 倍體積的異丙醇（約 740 ul），充分顛倒混勻，分兩次（每次不超過 700 ul）轉入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm 離心 1min，質粒被吸附在膜上，倒掉收集管中的濾液。直到所有混合溶液通過此吸附柱。

10. 可選步驟：向吸附柱中加入 500 ul 去蛋白液 PE，室溫 12,000 rpm 離心 30 sec，棄濾液。

（注意：去蛋白液 PE 為濃縮液，按要求加入無水乙醇，用后應立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發）

（注意：如果宿主菌是 endA-，如 DH5α，此步驟可省略。如果宿主菌是 endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101 等，此步驟不可省略，因這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質粒。如果提取低拷貝質粒也推薦采用此步驟）

11. 加入 600 ul 漂洗液 WB，室溫 12,000 rpm 離心 30 sec，棄濾液。

（注意：漂洗液 WB 為濃縮液，按要求加入無水乙醇，用后應立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發）

12. 重復步驟 11 一次。

13. 室溫 12,000 rpm 離心 2 min，甩干殘留液體，以免殘留乙醇抑制下游反應。

14. 將吸附柱置于一個新的 1.5 ml 離心管（自備）中，加入 100 ~ 200 ul 的洗脫緩沖液 EB，室溫放置 2 min，12,000 rpm 離心 1 min，離心管底溶液即質粒 DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中預熱洗脫緩沖液 EB，可增加洗脫效率；

如果需要較多量質粒，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，再次離心 1 min 收集；如需使用去離子水洗脫，可用 NaOH 調整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之間。）

無內毒素質粒小提中量提取試劑盒 核酸提取