酵母基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)

酵母基因組DNA快速提取試劑盒 核酸提取

目錄號：40210

v 適用范圍：

適用于快速提取各種酵母基因組DNA

v 試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。

儲存事項:

1. 結合液CB或者抑制物去除液IR低溫時可能出現析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復澄清透明后冷卻到室溫即可使用。

2. 為避免降低活性，方便運輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀（20mg），收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解配制成20mg/ml溶液，因為反復凍融可能會降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分裝凍存，－20℃保存。

3. 為避免降低活性，方便運輸，提供Lyticase(2500U)為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入0.25毫升滅菌水溶解配制成10U/μl，因為反復凍融可能會降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分裝凍存，－20℃保存。

4. 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

v 產品介紹：

該試劑盒采用DNA吸附柱和du有的溶液系統，適合于從多種來源的酵母培養物中快速簡單地提取基因組DNA。約3ml處于指數生長期的酵母培養液一般一次抽提可純化出10-15μg的高質量的基因組DNA。純化DNA產物可直接用于PCR、酶切和雜交等實驗。酵母細胞經lyticase處理去除細胞壁后，du特的結合液/蛋白酶K迅速裂解細胞和滅活細胞內核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜， 再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質膜上洗脫。

v 產品特點：

1. 離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口世界有名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。

2. 不需要使用有毒的苯fen等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

3. 快速，簡捷，單個樣品裂解后操作一般可在30分鐘內完成。

4. 多次柱漂洗確保高純度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值達1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應。

v 注意事項：

1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13,000rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。

2. 需要自備乙醇、異丙醇、β-巰基乙chun。 

3. 開始實驗前將需要的水浴先預熱到37℃和70℃備用。

4. 結合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

5. 用戶需要自備Sorbitol buffer( 1M 山梨chun，0.1M Na₂EDTA，14 mMβ-巰基乙醇)。配制方法：在600 ml 去離子水里面溶解182.2克山梨chun，加入200 ml 0.5 M Na₂EDTA (pH 8.0) ，不需要調節PH值，定容到1L，4℃保存。臨用前加0.1%β-巰基乙醇(商品化的β-巰基乙醇摩爾濃度一般為14M)。

6. 菌體濃度檢測一般OD600值為1的時候,釀酒酵母細胞是1-2x10⁷ cells/ml，由于菌種和分光度計不同即使同樣細胞數量OD值變化也很大，以上僅供參考。

7. 洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫，但應該確保批pH大于7.5，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。

v 操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）

提示：

e 第一次使用前請先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

e 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巰基乙醇，回復到室溫備用。

1. 取1-3毫升酵母培養物(不超過3X10⁷cells，最好是早對數生長期)，12,000rpm離心30秒，盡可能的吸棄上清，收集菌體。

收集超過1.5毫升菌液，可以離心棄上清后，在同一個1.5ml管內加入更多的菌液，重復步驟1，直到收集到足夠的菌體。

2. 加入600μl Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細胞；可按照20-50U/1x10⁷cells的比例加入Lyticase(一般3 ml培養物可能需要加到150U)，充分顛倒混勻，37℃溫育至少30分鐘消化細胞壁，中間可顛倒數次幫助消化。

如果破壁效果不好導致DNA產量低，可以加大lyicase用量來提高酶工作濃度，還可以延長消化時間來提高效果，不適合Lyticase消化的酵母可選用Zymolase或者其它方法如玻璃珠渦旋，煮沸，反復凍融等。

3. 13,000rpm離心1分鐘，盡可能吸棄上清，加180μl 緩沖液YB充分重懸細胞團。

4. 加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。

5. 將混合物放置在55℃水浴消化直到消化wan全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。

所需消化時間和酵母數量、種類和生長狀態有關，一般15分鐘即可，但是如果方便的話消化過夜也無不良影響。

可選步驟，一般不需要: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可在完成操作步驟5后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。

6. 加入200μl結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置10分鐘。

7. 冷卻后加入100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。

8. 將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。

9. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。

10. 加入700μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

11. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

12. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

13. 取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預熱效果更好），室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積，但是最小體積不應少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產量。

14. DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在－20℃。

v   問題與解決方法

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