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白介素ELISA試劑盒結(jié)果異常的原因分析2024/03/26: 白細(xì)胞介素，簡(jiǎn)稱(chēng)白介素，是指在白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴因子，它和血細(xì)胞生長(zhǎng)因子同屬細(xì)胞因子。兩者相互協(xié)調(diào)，相互作用，共同完成造血和免疫調(diào)節(jié)功能。白細(xì)胞介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。白介素ELISA檢測(cè)試劑盒兩大問(wèn)題問(wèn)題一：造成白介素ELISA試劑盒結(jié)果異常的原因A、試劑盒沒(méi)有按規(guī)定進(jìn)行保存，受高溫影響。B、試劑盒、樣品用前未平衡至室溫。C、加入試劑的體積和時(shí)間有誤，移液器計(jì)量不準(zhǔn)，吸嘴內(nèi)水分太多或不清潔。D、必須在有效期內(nèi)使用

流式細(xì)胞術(shù)(FCM)實(shí)驗(yàn)原理與應(yīng)用詳解2024/03/25: 流式細(xì)胞術(shù)：即FCM。很多小伙伴在做實(shí)驗(yàn)過(guò)程中會(huì)碰到很多問(wèn)題，比如：無(wú)信號(hào)、熒光強(qiáng)度高等一系列問(wèn)題，接下來(lái)就來(lái)聊聊流式細(xì)胞技術(shù)！目前，流式細(xì)胞術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)特征的分析，界定不同種類(lèi)的細(xì)胞群，測(cè)定分離出的亞類(lèi)純度，分析細(xì)胞的大小和總量，它可以同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)。它主要用于檢測(cè)標(biāo)記在抗體上的熒光強(qiáng)度，這些熒光抗體則可以檢測(cè)與特定細(xì)胞分子結(jié)合的蛋白或配體，如與DNA結(jié)合的溴化丙啶(PI)等。實(shí)驗(yàn)原理待測(cè)樣品(如細(xì)胞、染色體、精子或細(xì)菌等)經(jīng)熒光染料染色后制成樣品懸液，在一

細(xì)胞株培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題解決2024/03/22: 細(xì)胞株是用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。然而，細(xì)胞株在體外培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題，比如：細(xì)胞株無(wú)法在培養(yǎng)皿上貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞株生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞株死亡等。那么該如何解決呢？一、細(xì)胞株無(wú)法在培養(yǎng)器皿上貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞株胰酶消化過(guò)度：縮短胰酶消化時(shí)間或減少胰酶用量。2.支原體污染：隔離細(xì)胞株，檢測(cè)是否感染支原體；清洗通風(fēng)廚和培養(yǎng)箱，如細(xì)胞株被污染，滅菌處理后丟棄。3.培養(yǎng)基中無(wú)附著因子：如果使用的是無(wú)血清配方，應(yīng)確保含有附著因子

96孔板接種細(xì)胞鋪勻詳細(xì)步驟2024/03/21: 做實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞鋪勻是常見(jiàn)的一種。然而，有許多人不是很成功，分布也不均勻:要么中間密集，周?chē)∈瑁粗車(chē)芗虚g禿頂。以下是利用96孔板把細(xì)胞鋪勻，希望對(duì)大家有用!方法/步驟1、通常，在96孔板的每個(gè)孔中加入100微升細(xì)胞懸浮液。從底部附近的井的左側(cè)添加細(xì)胞懸浮液。加入一半平板后，混合細(xì)胞懸液，不要再加入，繼續(xù)加入剩余的一半平板。添加完所有板后，蓋上板，用左手輕輕握住板的左側(cè)，用右手輕輕輕敲板的右邊緣，注意抓力(我通常輕敲三次)。如果它太強(qiáng)或太多次，細(xì)胞就會(huì)被濃縮和堆積。順時(shí)針旋轉(zhuǎn)盤(pán)子(逆時(shí)針效

免疫組化(IHC)實(shí)驗(yàn)流程一目了然2024/03/20: 實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)介一、SP三步法1）石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。2)0.3%或3%H2O2去離子水（無(wú)色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。3）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘4）候選步驟：采用抗原修復(fù)：微波（建議30分鐘內(nèi)4次中火）、高壓、酶修復(fù)方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次.5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來(lái)源一致。傾去，勿洗。6）滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時(shí)或4℃過(guò)夜（最好復(fù)溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。7）滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫或37℃孵育30分

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備經(jīng)驗(yàn)分享2024/03/19: 細(xì)菌處于容易接受外源DNA的狀態(tài)稱(chēng)之為感受態(tài)，通過(guò)物理或化學(xué)的方法，人工誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞成為敏感的感受態(tài)細(xì)胞是重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌技術(shù)的關(guān)鍵。制備出感受態(tài)細(xì)胞，我們就可以方便的將需要克隆的質(zhì)粒導(dǎo)入其中，使其繁殖，從而獲得大量的質(zhì)粒。CaCl2轉(zhuǎn)化法是常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法，其制備流程簡(jiǎn)單，快捷，成本低，并且能夠滿足普通的轉(zhuǎn)化和克隆的需求。判斷感受態(tài)細(xì)胞制備的優(yōu)劣主要是通過(guò)轉(zhuǎn)化效率來(lái)檢測(cè)。經(jīng)轉(zhuǎn)化外源質(zhì)粒DNA的大腸桿菌在含抗性的LB平板過(guò)夜培養(yǎng)后，平板上長(zhǎng)滿克隆且陰性對(duì)照（未轉(zhuǎn)入外源DNA的感受態(tài)）沒(méi)

基準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)定法vs標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定法的區(qū)別2024/03/18: 先跟著遠(yuǎn)慕一起來(lái)認(rèn)識(shí)下標(biāo)準(zhǔn)溶液與基準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：已知準(zhǔn)確濃度的溶液，在各種滴定分析方法中都要用到標(biāo)準(zhǔn)溶液，可根據(jù)溶質(zhì)的性質(zhì)、特點(diǎn)，按不同方法配置，配制方法有直接配置法和間接配置法。基準(zhǔn)物質(zhì)：能用來(lái)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液或測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的物質(zhì)。應(yīng)具備如下條件：1、組成恒定并與化學(xué)式相符，若含結(jié)晶水，其結(jié)晶水的實(shí)際含量也應(yīng)與化學(xué)式嚴(yán)格相符。2、純度足夠高(達(dá)99.9%以上)，雜質(zhì)含量應(yīng)低于分析方法允許的誤差限。3、性質(zhì)穩(wěn)定，不易吸收空氣中的水分和二氧化碳，不分解，不易被空氣氧化。4、有較大的摩爾質(zhì)量，以減

熒光定量PCR中的8種對(duì)照詳細(xì)介紹2024/03/15: 對(duì)照的目的是對(duì)檢測(cè)的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控，因此我們按照檢測(cè)的流程對(duì)對(duì)照進(jìn)行梳理。常規(guī)熒光定量PCR的流程是：樣品采集-運(yùn)輸-樣品處理-核酸提取-反轉(zhuǎn)錄（RNA病毒）-擴(kuò)增-結(jié)果讀取。下面看看各個(gè)環(huán)節(jié)都可以使用哪些對(duì)照:1.陽(yáng)性對(duì)照（Positivecontrol，PC）和陰性對(duì)照（Negativecontrol，NC）陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是指在相同的處理?xiàng)l件下，比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品，都進(jìn)行了提取和擴(kuò)增最終獲得了陽(yáng)性結(jié)果和陰性結(jié)果。陰陽(yáng)性對(duì)照強(qiáng)調(diào)處理過(guò)程與樣品一致，并且有明確的預(yù)

【細(xì)胞培養(yǎng)】支原體污染來(lái)源及影響說(shuō)明2024/03/14: 支原體（Mycoplasma）是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間（0.1-0.6μm），沒(méi)有細(xì)胞壁、并獨(dú)立生活原核生物，形態(tài)呈高度多形性，呈圓形、絲狀或梨形。由于支原體直徑較小，進(jìn)行除菌過(guò)濾是，約1%的支原體可以直接穿過(guò)常規(guī)的0.22μm的微孔除菌濾膜，造成細(xì)胞的支原體污染。支原體污染的來(lái)源包括：（1）工作環(huán)境的污染，實(shí)驗(yàn)器材帶來(lái)的污染；（2）操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）；（3）已受污染的培養(yǎng)基、血清，或用來(lái)制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染；（4）污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染。目前，

PCR反應(yīng)的核心成份——DNA聚合酶的選擇2024/03/13: PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對(duì)于常年狂奔在實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)人來(lái)說(shuō)并不陌生。那么，對(duì)于PCR反應(yīng)的核心成份，DNA聚合酶，你選對(duì)了嗎？常見(jiàn)的DNA聚合酶如Taq、Phanta、Pfu、KOD、Primerstar、Klenow、Bst、Phi29等等。根據(jù)耐熱性來(lái)分可分為耐熱酶和常溫酶。耐熱聚合酶如Taq、Pfu、KOD、Primerstar等，常溫聚合酶包括Klenow、Bst、Phi29等。根據(jù)保真度來(lái)分，高保真聚合酶Pfu、KOD、Phanta等，普通聚合酶Taq等。DNA聚合酶的功能1）通過(guò)核苷酸

【定量分析】外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法選擇不再困難！2024/03/12: 在實(shí)驗(yàn)室里做了無(wú)數(shù)次定量分析實(shí)驗(yàn)的你知道內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法有何區(qū)別嗎？對(duì)于內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)哪種更好用，我們不能一概而論，畢竟面對(duì)著不同的分析、不同的要求。做定量分析實(shí)驗(yàn)，只要能簡(jiǎn)單又高效的進(jìn)行定量分析才是最重要的。什么是內(nèi)標(biāo)法？?jī)?nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí)，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校準(zhǔn)和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。內(nèi)標(biāo)法例如加入一個(gè)不常見(jiàn)的元素如In等，測(cè)量曲線和樣品的時(shí)候同時(shí)測(cè)定這個(gè)元素相同濃度，假如內(nèi)標(biāo)物強(qiáng)度變化不大說(shuō)明基體干擾小，

實(shí)驗(yàn)室常用細(xì)胞裂解方法介紹2024/03/11: 細(xì)胞破碎是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁,使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來(lái)的技術(shù),是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)(產(chǎn)品)的基礎(chǔ)。結(jié)合重組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進(jìn)展,以前認(rèn)為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。但是由于細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞壁的組成成分不同,且同類(lèi)細(xì)胞結(jié)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也不同,所以其細(xì)胞壁的堅(jiān)固程度不同。而動(dòng)物細(xì)胞雖沒(méi)有細(xì)胞壁,但具有細(xì)胞膜,也需要一定的細(xì)胞破碎方法來(lái)破膜,達(dá)到提取產(chǎn)物的目的。一般用物理或者化學(xué)方法來(lái)使得細(xì)胞裂解物理法：（1）反復(fù)凍融：將細(xì)胞反復(fù)放置于

質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題分析2024/03/08: 質(zhì)粒提取原理現(xiàn)在較常用的質(zhì)粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為劇烈，適用于較小的質(zhì)粒（＜15Kb），而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質(zhì)粒（＞15Kb）。堿裂解法是一種廣泛使用的制備質(zhì)粒DNA的方法。其原理為：染色體DNA遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒DNA，染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒為共價(jià)閉合環(huán)狀分子。當(dāng)pH12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子的染色體DNA完quan變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA在將PH調(diào)至中性后即可以恢復(fù)其天然構(gòu)象，在高鹽濃度存在的條件下，染色體

【細(xì)胞解讀】細(xì)胞株GMP建庫(kù)及檢測(cè)法規(guī)2024/03/07: ICH指導(dǎo)原則國(guó)際人用藥品技術(shù)要求協(xié)調(diào)委員會(huì)(ICH)將監(jiān)管機(jī)構(gòu)和制藥行業(yè)聚集在一起討論藥品開(kāi)發(fā)，注冊(cè)科學(xué)和技術(shù)，旨在簡(jiǎn)化流程與組織結(jié)構(gòu)，以加速醫(yī)藥開(kāi)發(fā)管制流程，縮短病患采用新醫(yī)藥所需要的時(shí)間。2017年ICH會(huì)議通過(guò)了中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局的申請(qǐng)，總局成為國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)正式成員。目前，ICH指導(dǎo)原則已成為國(guó)際通用的指導(dǎo)原則。ICH指導(dǎo)原則分為四類(lèi)，Q：質(zhì)量指導(dǎo)原則；S:安全性指導(dǎo)原則；E:有效性指導(dǎo)原則；M:多學(xué)科指導(dǎo)原則，其中章節(jié)對(duì)細(xì)胞庫(kù)的質(zhì)量有如下規(guī)定：一、細(xì)胞基質(zhì)的來(lái)源

【基本操作】大腸桿菌菌種培育技術(shù)2024/03/06: 為了能夠長(zhǎng)期的保存大腸桿菌菌種且不破壞其結(jié)構(gòu)，通常將含有足量細(xì)菌的液體培養(yǎng)基離心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80℃凍存。之所以選擇甘油是因?yàn)楦视图词乖诔蜏貎鼋Y(jié)的情況下其體積也不會(huì)產(chǎn)生劇烈變化，不會(huì)導(dǎo)致由于其冰凍后體積的改變而壓迫菌種導(dǎo)致菌種結(jié)構(gòu)的改變。等到需要的時(shí)候再將超低溫冷凍的菌體，融化并培養(yǎng)即可。由于此時(shí)僅僅需要將菌種培養(yǎng)至符合其種子液的數(shù)量要求而無(wú)需考慮培養(yǎng)產(chǎn)物以及繁殖速度等問(wèn)題，所以一般采用最基礎(chǔ)的LB培養(yǎng)基即可。LB培養(yǎng)基配方胰化蛋白胨（Trypton）：10g/L；酵母提取物

PCR失敗因素與解決方法2024/03/05: 一、模板質(zhì)量問(wèn)題：1）模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。可以跑個(gè)電泳看看提取的DNA，PCR陽(yáng)性樣品與陰性樣品是否有明顯差別。如果確定是這種問(wèn)題，可以增加模板量試試，但不一定行得通。2）模板里面殘留某種試劑成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是這種情況，可以用試劑盒把模板再純化一下，或?qū)⒛０遄鰝€(gè)梯度稀釋以確定最佳的模板量。3）為什么跑電泳會(huì)出現(xiàn)拖帶呢？1.有可能的因?yàn)槟愕碾妷赫{(diào)的太高了。電泳跟很多因素有關(guān)，其中就有一個(gè)是電壓，在適當(dāng)?shù)碾妷悍秶鷥?nèi)增加是可以加快遷移速率，但

蛋白質(zhì)分離純化也可以很簡(jiǎn)單！2024/03/04: 蛋白質(zhì)的分離純化方法：一、根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析法：中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱(chēng)鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱(chēng)鹽析。2、等電點(diǎn)沉淀法：蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的ph達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。3、低溫有機(jī)溶劑沉淀法：用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或

抽提RNA實(shí)驗(yàn)色素污染去除方法2024/03/01: 用Trizol法沉淀RNA容易有一些雜質(zhì)的。部分色素是會(huì)和RNA一起沉下來(lái)。這種情況可以用75%冷的乙醇多洗幾遍。對(duì)后續(xù)qRT-PCR多數(shù)情況下沒(méi)什么影響。另外可以用硅膠柱法純化RNA，色素殘留會(huì)少一些。RNase污染的來(lái)源1：手指頭–手指頭是外源酶的第1來(lái)源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因?yàn)楹粑彩且粋€(gè)重要的酶來(lái)源。戴手套口罩的另外的好處是保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員。2：槍頭，離心管，移液器單純的滅菌是不能滅活RNase的，所以槍頭和離心管要用DEPC處理，即使是標(biāo)明為DEPC處理過(guò)的。

細(xì)胞培養(yǎng)基的除菌方式及注意事項(xiàng)2024/02/29: 細(xì)胞培養(yǎng)基滅菌的方式分為高壓滅菌和膜過(guò)濾除菌，不同的培養(yǎng)基由于其營(yíng)養(yǎng)成份不同，滅菌方式也可能不同。某些培養(yǎng)基（如MEM）可進(jìn)行高壓滅菌，這類(lèi)培養(yǎng)基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，一般是在培養(yǎng)基高壓滅菌后才加入。另外可用耐高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）代替L-谷氨酰胺。可高壓滅菌的培養(yǎng)基在121℃、15psi，15分鐘的條件下wan全可達(dá)到滅菌效果及營(yíng)養(yǎng)成分的最小損失，不需將滅菌時(shí)間延長(zhǎng)。絕大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基不適宜高壓滅菌。因培養(yǎng)液中常含有維生素、蛋白質(zhì)、多肽、生長(zhǎng)因子等物質(zhì)，這些物

發(fā)酵過(guò)程染菌及其防治步驟2024/02/28: 發(fā)酵染菌：指在發(fā)酵過(guò)程中生產(chǎn)菌以外的其他微生物侵入了發(fā)酵系統(tǒng)，從而使發(fā)酵過(guò)程失去真正意義上的純種培養(yǎng)。染菌對(duì)發(fā)酵的影響一、染菌對(duì)不同發(fā)酵過(guò)程的影響1、青霉素發(fā)酵過(guò)程：由于許多雜菌都能產(chǎn)生青霉素酶，因此不管染菌是發(fā)生在發(fā)酵前期、中期或后期，都會(huì)使青霉素迅速分解破壞，使目的產(chǎn)物得率降低，危害十分嚴(yán)重。2、核苷或核苷酸發(fā)酵過(guò)程：由于所用的生產(chǎn)菌種是多種營(yíng)養(yǎng)缺陷型微生物，其生長(zhǎng)能力差，所需的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，因此容易受到雜菌的污染，且染菌后，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制了生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的

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