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蛋白質(zhì)純化膠體過濾法步驟2023/08/28

不同大小的蛋白質(zhì)分子進(jìn)入膠體過濾管柱，可依其分子量差異分離；是一種廣泛應(yīng)用的partition色析法（Pharmacia操作手冊，GelFiltration）。儀器設(shè)備：色析管柱（PharmaciaCcolumn,1.6×100cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（fractioncollector,需準(zhǔn)備干凈試管約100支）；濃縮用離心機（低速5,000rpm）；濃縮用離心管Centriprep-30（Amicon4322）請注意其使用方法藥品試劑：膠體SephacrylS-300（Phar

實驗室推選：ELISA實驗結(jié)果出現(xiàn)各種問題解決方案2023/08/21

ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。在檢測時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗原）與固相載體表面的抗體反應(yīng)。洗滌后加入酶標(biāo)記的抗體，通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。ELISA實驗結(jié)果出現(xiàn)異常剖析：一、白板異常：顯色步驟結(jié)束后，酶標(biāo)板所有孔均無顏色。陽性對照不顯色。1

資訊推送：抗體科學(xué)保存指引2023/08/16

抗體保存得當(dāng)與否，直接決定了抗體的活性和使用效果！如果抗體保存得當(dāng)，大部分抗體活性都可以維持?jǐn)?shù)月甚至數(shù)年。請謹(jǐn)記無論何時請按照說明書推薦的保存條件正確保存抗體.抗體濃度過低（1、多克隆抗體多克隆抗體在血清中于-20℃保存十年其活性損失不大。然而，一旦抗體被純化后，儲存在50%的甘油中于-20℃保存，即使沒有凍融，其活性的損失也可以觀察到，盡管其進(jìn)程仍然非常緩慢。即使沒有甘油，只要你b反fu凍融，抗體也可以存儲在-20℃幾年甚至幾十年。另一個重要的事情是，該抗體濃度應(yīng)高于1毫克/毫升，因為稀的抗體

污染細(xì)胞價值較大清除回收辦法2023/08/07

培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。在細(xì)胞培養(yǎng)中如果污染細(xì)胞價值不大，宜棄之；在尋找原因后徹di消毒操作室，復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞，再進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。污染細(xì)胞價值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。1、細(xì)菌和真菌的清除抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥。預(yù)防用藥比污染后再用藥。預(yù)防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。2、支原體的清除(1)、用MRA處理用MRA（MycoplasmaRemoval

微生物篩選鑒別方法及培養(yǎng)注意事項2023/08/01

一、微生物的篩選方法1、單菌落挑取法:利用平板劃線法或稀釋涂布平板法接種在固體培養(yǎng)基表面，根據(jù)目的微生物特定的菌落特征，利用單菌落挑取的方法挑選目的微生物2、選擇培養(yǎng)法:利用選擇培養(yǎng)基對微生物進(jìn)行選擇培養(yǎng)，直接篩選目的微生物3、鑒定培養(yǎng)法:利用鑒別培養(yǎng)基使目的微生物菌落呈現(xiàn)te有的特征，然后篩選目的微生物4.根據(jù)功能可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。二、微生物的鑒別方法1、菌落特征鑒別法:根據(jù)微生物在固體平板培養(yǎng)基表面形成的菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等特征進(jìn)行鑒別2、指示劑鑒別法:如在以尿素為

蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑各自作用特點2023/07/24

1、蛋白酶抑制劑破碎細(xì)胞提取蛋白質(zhì)的同時可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì)不被降解。在蛋白質(zhì)提取過程中，需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。蛋白酶抑制劑（proteaseinhibitor）從廣義上指與蛋白酶分子活性中心上的一些基團(tuán)結(jié)合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白變性的物質(zhì)。各種蛋白酶對不同蛋白質(zhì)的敏感性各不相同，因此需要調(diào)整各種蛋白酶的濃度。由于蛋白酶抑制劑在液體中的溶解度極低，尤其應(yīng)注意在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑時應(yīng)充分混勻以減少蛋白酶抑制劑的沉淀。常用的蛋

血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實際篩選血清方法2023/07/10

血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：1.內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)為不高于5EU/ml2.總蛋白含量胎牛血清一般范圍是30-40mg/ml，數(shù)值偏高偏低都會影響實驗的正常進(jìn)行3.血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)為不高于20mg/dl4.pH。國產(chǎn)血清、大多高于7.5，進(jìn)口胎牛血清，大多低于7.5，根據(jù)PH的高低可用來初步鑒別血清的來源5.微生物。包括細(xì)菌、霉菌、支原體、噬菌體、各類病原性病毒等，大多都能清除。大腸桿菌噬菌體無法過濾，很難徹di清除，但對血清質(zhì)量影響不大。病原性病毒，在國產(chǎn)血清中幾乎90%以上都存在，是影響國產(chǎn)血清質(zhì)量的重要原因之一在實

ELISA實驗出現(xiàn)異常剖析2023/07/03

ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。在檢測時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗原）與固相載體表面的抗體反應(yīng)。洗滌后加入酶標(biāo)記的抗體，通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。ELISA實驗結(jié)果出現(xiàn)異常剖析：一、白板異常：顯色步驟結(jié)束后，酶標(biāo)板所有孔均無顏色。陽性對照不顯色。1

獲取純化原代細(xì)胞方法合集2023/06/27

原代細(xì)胞分離的方法有多種，常用的是機械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法，下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的原代細(xì)胞。1、胰蛋白酶純化法1）、在去除不需要的組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。2）、將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100mg組織加入1ml胰蛋白酶）。3）、在4℃孵育6到18小時，使幾乎沒

ELISA試劑盒中各HRP底物操作說明2023/06/05

ELISA試劑盒中HRP底物范圍較廣，HRP即辣根過氧化物酶（HorseradishPeroxidase）比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以zui常用。過氧化物酶作為多個試劑盒顯色體系的關(guān)鍵成分，對試劑盒的質(zhì)量有重要影響。HRP底物主要包括二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。一、二氨基聯(lián)苯胺／金屬鹽DAB是辣根過氧化物酶最敏感、常用的底物。它產(chǎn)生強烈的棕色產(chǎn)物，在水和醇中不溶解。多數(shù)情況下，推薦在DAB中加入不同的金屬離子。當(dāng)加入金屬鹽如鈷、鎳至底物液中，辣根過氧化物酶可以更

ELISA試劑盒實驗包被條件選擇指南2023/05/29

ELISA試劑盒實驗包被條件選擇指南：1、包被抗原的選擇包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類。天然蛋白需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被，對于含雜質(zhì)較多的抗原可以采用間接捕獲法包被(先用能夠與目的抗原反應(yīng)的物質(zhì)如抗體直接吸附在酶標(biāo)板上，再通過特異性反應(yīng)使抗原固相化)。經(jīng)純化的重組蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機化合物，由于分子量太小，往往難于直接吸附在酶標(biāo)板上，一般都先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如BSA等偶聯(lián)，偶聯(lián)物吸附于固相載體上。2、包被液的選擇一般常用的是pH9.6

抗原抗體反應(yīng)的特性解析2023/05/24

抗原抗體反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。這種反應(yīng)既可在機體內(nèi)進(jìn)行，也可以在機體外進(jìn)行。抗原抗體反應(yīng)的過程是經(jīng)過一系列的化學(xué)和物理變化，包括抗原抗體特異性結(jié)合和非特異性促凝聚兩個階段，以及由親水膠體轉(zhuǎn)為疏水膠體的變化。抗體能特異性地識別相應(yīng)的抗原，并與之結(jié)合。這種結(jié)合在體外也能發(fā)生，這種抗原抗體反應(yīng)模式圖特性就是許多免疫檢測方法的基礎(chǔ)。抗原與抗體相互作用是非共價的，可逆的，其特性符合許多化學(xué)反應(yīng)的基本原理。但因為抗體分子的結(jié)構(gòu)特點，以及抗原分子結(jié)構(gòu)的多樣性，使抗原抗體結(jié)合反應(yīng)表現(xiàn)

實驗干貨，PCR反應(yīng)常見問題分述2023/05/15

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR反應(yīng)常見問題分述如下：1．假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋

影響ELISA試驗結(jié)果必看事項清點2023/05/05

ELISA試劑盒實驗以靈敏度較高、特異性較好的特點在科研領(lǐng)域上得到了廣泛的應(yīng)用，但操作中的各個環(huán)節(jié)對實驗的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果。影響ELISA試驗結(jié)果必看事項清點：1、操作應(yīng)對試驗的物理參數(shù)有充沛的了解，如環(huán)境溫度(保持在18c～25℃)、反響孵育溫度和孵育時刻、洗刷的次數(shù)等，要先查看水育箱溫度，是否符合要求。2.正確運用加樣器加樣器應(yīng)筆直參加標(biāo)本或試劑，ELISA試劑盒防止刮擦包被板底部。加樣過程中防止液體外濺，血清殘留在反響孔壁上，加樣器吸頭要清洗干凈，

ELISA檢測結(jié)果解讀2023/04/23

ELISA檢測結(jié)果可以定量、定性或半定量地解釋。在定量檢測中，使用已知標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)稀釋液來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，通常是光密度（OD）與濃度的關(guān)系。由此，可以計算出未知樣品中目標(biāo)物的精確數(shù)量。標(biāo)準(zhǔn)曲線計算和ELISA實驗中未知物目標(biāo)濃度測定示例在定性檢測中，通常仍會通過使用酶標(biāo)儀來收集數(shù)據(jù)，但結(jié)果將通過與沒有標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白和/或陰性孔的比較來解釋為陽性或陰性。半定量檢測也是在不使用連續(xù)稀釋或標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下收集數(shù)據(jù)。然而，包含陰性和陽性標(biāo)準(zhǔn)，通常是高陽性和低陽性，有利于相對比較未知樣本井和已知狀態(tài)的樣本孔之

ELISA吸光度值衰減探究2023/04/20

在做elisa試劑盒實驗的時候,ELISA吸光值一直在衰減這樣的現(xiàn)象。在加完顯色液(購買)顯色一定時間后，再加終止液（2MH2SO4，自己配制）后，立即測試其吸光度值，等過幾分鐘再測試吸光度值，發(fā)現(xiàn)兩次測得的吸光度值發(fā)生衰減。第二次均小于次。并且，加終止液時，從條加到第12條后，測試發(fā)現(xiàn)，吸光度值從1-12條逐級衰減。前提是這12條酶標(biāo)板都是同一種產(chǎn)品，并且包被相同蛋白。原來ELISA吸光度值衰減可以這樣巧妙應(yīng)對。其實具體的原因也很簡單，有可能是顯色液的質(zhì)量不夠好。一般情況下，終止反應(yīng)后OD值的

ELISA試劑盒包被用抗原與抗體概述2023/04/10

一、ELISA試劑盒包被用抗原用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細(xì)菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提取）。重組抗原是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無傳染性，但純化技術(shù)難度較大。以大腸桿菌為質(zhì)

五種類型的生化試劑盒簡介及意義2023/03/20

五種類型的生化試劑盒：多酚氧化酶（PPO）活性檢測試劑盒（比色法），血鉀（K?）、甘油三酯（TG）、游離膽固醇（FC）、總膽固醇（TC）檢測試劑盒（比色法）。1.多酚氧化酶（PPO）活性檢測試劑盒（比色法）：多酚氧化酶（PPO）能夠催化Catechol產(chǎn)生醌，后者在525nm有特征光吸收，測定525nm光吸收增加的速率進(jìn)而計算多酚氧化酶（PPO）活性。該試劑盒適用的樣本范圍廣泛包括血清、血漿、組織、細(xì)胞、細(xì)菌；而且細(xì)致優(yōu)化了樣本處理方法、實驗操作流程以及結(jié)果計算過程。2.血鉀（K?）檢測試劑盒（

PCR技術(shù)溫度與時間的把控解說2023/03/13

溫度與時間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性)。1、變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不wan全是導(dǎo)致P

實驗選擇合適的抗體要點指南2023/03/06

實驗室科研工作離不開抗體，WB、IP、IHC、IF、ChIP和FC都需要用到抗體，那科研實驗室如何選擇合適的抗體呢？一.一抗選擇要點:1）.確定抗體的名字。注意中英文名字、它名、亞型等信息。2）確定你的實驗類型。Elisa，WB，IHC，ICC，還是FACS。一般抗體的說明書都會列出該抗體經(jīng)驗證過適用于何種實驗的類型，如果抗體說明書沒有提及的應(yīng)用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型，而僅是說明尚未經(jīng)過此種實驗驗證，請根據(jù)說明書列出的已驗證的類型來選擇適合你實驗的抗體。3）.確定實驗樣本