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楊艷 連浩志

二維液相色譜技術

二維液相色譜分離技術是利用兩根性質不同的色譜柱對復雜樣品中的待分析組分進行分離。不同的液相色譜模式如排阻色譜（SEC）、親和色譜、離子交換色譜（IEC）、疏水作用色譜（HIC）、反相色譜（RP）等都可以用來組合、構建二維液相色譜。

近年來二維液相色譜分離技術被廣泛應用于抗體藥物領域。中心切割二維液相方法和全二維液相方法的工作流程用于指導抗體藥和生物類似藥研發過程中的單克隆篩選。一維使用親和色譜方法，二維使用排阻色譜（SEC）、陽離子交換（CEX）或反相色譜串聯質譜法可以評估抗體的滴度、關鍵結構特征比如聚集體、片段、電荷異質體、分子量、氨基酸序列和糖基化[1]。Yi Li[2]等人利用中心切割二維液相方法分析ADC藥物中的未偶聯小分子相關雜質，該方法的一維是排阻色譜（SEC），將ADC藥物和未偶聯小分子相關雜質分離開；然后使用中心切割的方式，將一維的未偶聯小分子相關雜質切割到第二維反相色譜串聯質譜，進行在線除鹽、未偶聯小分子相關雜質鑒定并測定含量，3種未偶聯小分子相關雜質的線性均為0.9999，回收率在95%-105%。

抗體藥Actemra

Actemra（托珠單抗）是重組人源化IgG1抗體，是人源化白細胞介素6（IL-6）受體拮抗劑。Actemra用于治療類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎等。

圖1.托珠單抗Actemra（圖片來源于網絡，如涉及侵權，請告知，立刪）

SEC-RP串聯質譜的二維液相色譜

高效表征Actemra

本實驗一維使用排阻色譜法（SEC）測定抗體藥Actemra的聚集體、主峰、片段含量。因為一維使用流動相是質譜不兼容的鹽，所以將一維的各個峰進行中心切割，切到loop環中，然后使用二維質譜兼容的流動相將loop環中的餾分沖到二維反相色譜柱中進行除鹽并將目標物洗脫進入質譜檢測器進行檢測。

01

儀器配置：

· Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex 系列液相色譜

· Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 質譜儀

· Thermo Scientific™ BioPharma Finder™ 軟件

02

一維色譜條件：

分析柱：SEC色譜柱

柱溫：室溫

進樣量：2 µl

流速：0.15 mL/min

流動相：100 mM PB+100 mM NaCl，pH7；等度

紫外檢測器：280 nm

03

二維色譜條件：

分析柱：MAbPac™ RP（2.1 X 50 mm）

柱溫：60℃

紫外檢測器：280 nm

流動相：流動相A：0.1%FA-H2O；流動相B：0.1%FA-ACN；

流動相梯度表：見圖2

圖2.二維流動相梯度表

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04

質譜參數設置：

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實驗結果：

抗體藥Actemra的SEC-HPLC的譜圖見圖3，該樣品主峰含量97.0%，片段1含量2.0%，片段2含量0.2%。以上含量按峰面積百分比進行計算的。

圖3. 抗體藥Actemra的SEC-HPLC譜圖

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根據目標峰的峰保留時間對2位6通閥進行閥切換。主峰選擇7.0-7.5min時間段切到250 μL的loop環中，片段1選擇7.5-8min時間段切到250 μL的loop環中，片段2選擇8.7-9.2min時間段切到250 μL的loop環中。主峰的去卷積結果見圖4，根據已知氨基酸序列進行數據處理，得到相應的分子量和對應糖型修飾。片段1的去卷積結果見圖5，該片段的分子量約為100 KD，推測是兩條重鏈組成，具體的還需通過肽圖做進一步鑒定。另外片段1去卷積后相鄰分子量均相差約162 Da（除100551 Da之外），推測是相差一個糖修飾。片段2的總離子流圖、去卷積結果圖和原始質譜圖見圖6-8，盡管片段2含量只有0.2%，利用二維液相的方法，在線中心切割到第2維反相，保留時間為19.382min，總離子流圖的響應強度有2.7E8，在當前質譜儀器上有很好的響應，完全可以進行在線檢測。片段2的分子量約為47 KD，具體的還需通過肽圖做進一步鑒定。

圖4.主峰的去卷積譜圖

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圖5.片段1的去卷積譜圖

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圖6.片段2的總離子流圖

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圖7.片段2的原始質譜圖

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圖8.片段2的去卷積譜圖

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結論：

通過一維排阻色譜法（SEC）分離抗體藥Actemra的聚集體、主峰、片段；通過二維反相色譜柱進行除鹽并將目標物洗脫進入質譜檢測器進行檢測鑒定，該方法可以快速獲得抗體藥物的聚集體、主峰、片段的含量，同時除掉一維的鹽并可以獲得抗體藥物各峰的分子量和相應糖型修飾。該方法適用于抗體藥物研發的單克隆篩選及后續穩定性研究質控中。

參考文獻：

[1] Koen Sandra,Mieke Steenbeke,Isabel Vandenheede,et al.The versatility of heart-cutting and comprehensive two-dimensional liquid chromatography in monoclonal antibody clone selection.Journal of Chromatography A,2017.

[2] Yi Li,Christine Gu,Jason Gruenhagen,et al.A size exclusion-reversed phase two dimensional-liquid chromatography methodology for stability and small molecule related species in antibody drug conjugates. Journal of Chromatography A,2015,81-88.

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