本文要點：近紅外二區(NIR-II, 1000-1700 nm) 熒光成像對于體內深層生物結構的準確可視化具有巨大潛力。然而，當前 NIR-II熒光探針的微弱熒光仍然是對不斷增長的成像需求的長期挑戰。本文通過將二氧化硅涂層的金納米棒 (GNR) 和聚合物點 (Pdots) 結合到多層納米結構中，實現表面等離子體增強 NIR-II熒光策略，在 NIR-II 成像窗口中實現了高達 6.4 的增強因子。表面等離子體增強方法已成功擴展到具有 NIR-II發射的幾種類型的 Pdots 熒光團。本文最終對多層探針進行了外層封裝和聚乙二醇化，并展示了表面等離子體增強的 NIR-II熒光，實現小鼠穿顱腦成像。與臨床批準的ICG相比，它表現出精細的信噪比和穿透深度。

GNR@SiO2-Pdot 納米結構的設計和制造

Schemem 1 顯示了用于表面等離子增強 NIR II熒光的多層納米探針的設計策略。作為等離子體材料，GNR 具有顯著的特性：可調節的縱向等離子體峰、大的消光截面、良好的化學穩定性和高生物兼容性。大表面積和易于功能化使 GNR 成為生物分子固定化和靶向藥物遞送的理想載體。在這項工作中，作者利用 GNR 的表面等離子共振特性來增強 Pdots 的 NIR-II 熒光。對于體內應用，已知藥代動力學和生物分布明顯受粒徑和表面功能化的影響。本文將 GNR 進行后續二氧化硅封裝，目的是通過調整二氧化硅殼厚度來優化等離子體增強。首先通過改進的無核方法制備小型 GNR，并通過十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB) 進行穩定。對GNR進行了形態表征（Figure 1A），微型 GNR 可以有效地減小后續納米探針的最終尺寸和修改過程，并避免了隨著吸收截面減小而產生的強烈散射，保持了 GNRs 極hao的吸收和激發增強能力。

文章選擇半導體聚合物作為 NIR-II熒光發射模塊，因為它們具有良好的光穩定性和大的吸收截面，有助于制備具有良好重現性和高亮度的 NIR-II納米探針。制備得的 Pdot（m-PBTQ4F）量子產率3.2%，比非氟化對應物亮 3 倍以上。 PSMA是一種兩親性功能聚合物，在 Pdot 制備過程中引入以產生表面羧基，這使得隨后的靜電組裝成為可能。Pdot在水中分散良好，其平均流體動力學直徑約18 nm（Figure 1B）。 TEM 圖像顯示 Pdot 呈球形。光譜結果（Figure 1C）表明，Pdots 的熒光光譜擴展到 NIR-II 區域，熒光發射峰位于 994 和 1120 nm，肩峰位于 1300 nm 以上。此外，GNR 的吸收光譜在 805 nm 附近表現出縱向等離子體峰，同時與用于 NIR-II成像的 808 nm 激發光和 Pdot 的吸收峰很好地匹配。

已經證明，當熒光團直接與等離子體納米粒子接觸時，非輻射能量通過激發熒光團的弛豫迅速轉變為表面等離子體共振；因此可能會發生熒光猝滅而不是熒光增強。為了避免熒光猝滅，在 GNR 和 Pdot 之間引入二氧化硅作為間隔層，并且設計了GNR@SiO2-Pdot 納米粒子用于 NIR-II熒光增強。

首先，與 GNR 結合的劇毒 CTAB 被生物兼容性 PEG-SH 取代，這不僅有利于體內應用，而且有利于后續的二氧化硅涂層。配體交換過程不會改變 GNR 的良好分散性（Figure 1D）。隨后，組裝二氧化硅圖層，其厚度可以通過改變反應時間和前體濃度來調節。然后，通過氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES) 改性過程，將GNR@SiO2 納米顆粒與胺基團官能化。-NH2質子化為GNR@SiO2納米顆粒提供了正電荷，帶負電的 Pdots 通過靜電相互作用組裝到帶正電的 GNR@SiO2納米顆粒的表面上。通過TEM圖像與光譜證實了 Pdots 通過靜電相互作用成功組裝到 GNR@SiO2納米顆粒上。

GNR@SiO2-Pdots 的表面等離子增強 NIR-II 熒光

作者研究了GNR@SiO2-Pdot 多層探針中的表面等離子體增強 NIR-II熒光。在 808 nm 激光的激發下測量熒光發射光譜。與相同熒光團濃度（10 μg mL-1）下的游離 Pdots 相比，GNR@SiO2-Pdots的發射強度顯著增強（Figrue 1H）。通過單獨比較~1000 nm處的熒光峰強度，增強因子可以增加5倍，揭示了GNR@SiO2-Pdots NIR-II熒光的顯著增強效果。Figure 1E 顯示，與 SiO2納米顆粒混合后，Pdots 熒光強度略有降低；與 CTAB 封端的 GNR（無二氧化硅殼）混合時，觀察到到明顯的熒光猝滅。Figure 1I成像結果清楚地表明只有GNR@SiO2-Pdots 有熒光增強效應，與光譜測量結果一致。這些觀察結果證明了二氧化硅間隔層的重要性。

GNR@SiO2-Pdots 的距離依賴 NIR-II 熒光增強

作者合成了一系列二氧化硅殼厚度不同的GNR@SiO2-Pdot 多層探針。根據TEM圖像，硅殼的厚度分別為3.7、8.6、11.4和15.3 nm。作為對照，還制備沒有二氧化硅層的GNR- Pdots。然后將Pdots組裝到納米顆粒表面，形成具有不同厚度的硅厚度的GNR@SiO2-Pdots。

Figure 2D光譜分析表明，在沒有二氧化硅層的GNR-Pdots中，熒光被猝滅；在二氧化硅厚度為3.7 nm的GNR@SiO2-Pdots中明顯增強。隨著二氧化硅厚度的進一步增加，NIR-II發射在8.6 nm二氧化硅厚度處達到zui jia增強，在11.4和15.3 nm二氧化硅厚度處減弱。結果一致表明，表面等離子體增強的NIR-II熒光明顯依賴于二氧化硅層的厚度。

為了驗證等離子體系統增強 Pdot 的 NIR-II 熒光的普遍性，制備了具有不同二氧化硅厚度和不同類型 Pdots （p-PBTQ2F、p-PBTQ4F 和 m-PBTQ2F）的多層 GNR@SiO2-Pdots，然后分別進行了熒光光譜和 NIR-II 成像的表征（Figure S8 和 S9）。作者將 NIR-II 圖像中 GNR@SiO2-Pdots 相對于游離 Pdots 的綜合 NIR-II 熒光強度定義為增強因子。Figure 2F 顯示了四種類型的 GNR@SiO2-Pdots 的增強因子隨二氧化硅間隔層厚度的變化趨勢。結果表明，隨著二氧化硅厚度的增加，4種類型的納米探針表現出相似的增強趨勢，在8.6 nm二氧化硅厚度處，p-PBTQ2F、p-PBTQ4F、m-PBTQ2F和m-PBTQ4F Pdots的zui jia增強因子分別為6.4、5.8、4.9、3.9。四種類型的Pdots的增強因子不同，可能是由于GNRs的吸收光譜與Pdots的吸收光譜有不同的重疊。四種類型的Pdots的粒徑也略有不同，從而改變了Pdots到GNRs的平均距離。這些因素會影響最終的熒光增強。

用于通過顱腦成像的表面等離子增強 NIR-II 熒光

作者將GNR@SiO2- Pdots 探針應用于小鼠大腦的顱內血管成像。為了提高穩定性，GNR@SiO2-Pdots用 PVP 進一步穩定，然后用外部二氧化硅層封裝，以防止 Pdots 在復雜的生物環境中從 GNR@SiO2上解離。已證明用聚（乙二醇）（PEG）密集涂覆納米材料可增加體內循環時間。因此，通過硅烷-PEG在二氧化硅外表面的水解和縮合，GNR@SiO2-Pdots@SiO2被 PEG 功能化。最終探針的熒光光譜形狀類似于GNR@SiO2-Pdots。外層二氧化硅涂層后 NIR-II熒光強度幾乎保持不變，而 PEG 化可以大大改善靜脈注射探針后的血液循環時間。

使用聚乙二醇化GNR@SiO2-Pdots@SiO2 探針通過頭皮和顱骨對小鼠大腦的血管結構進行成像，并與ICG的成像結果進行了比較。前者血管的熒光強度要強得多，復雜的分支在視覺上比ICG更清晰，并且來自血管結構的強熒光信號在靜脈注射后 2 小時保持在初始強度的約 80%。這些結果表明，本文探針憑借其高信噪比和長保留能力，在 NIR-II熒光成像中優于 ICG。最后，評估了小鼠的全身熒光成像。如Figure 3B所示，整個小鼠全身的血管結構在仰臥位和俯臥位時都以高質量清晰地成像。當鼠標處于俯臥位時，可以清楚地觀察到血管，通過成像系統 SBR 等于 3.1（Figure 3C）。在仰臥位成像時，后肢血管系統的 SBR 高達 7.5（Figure 3D）。總之，這些成像結果表明，本文合成的多層探針等離子體增強 NIR-II熒光在動物研究中具有高對比度光學成像的巨大潛力。

參考文獻

Peng, L.; Liu, Y.; Zhang, J.; Zhang, Z.; Liu, Z.; Fang, X.; Wang, Y.; Wu, C., Surface Plasmon-Enhanced NIR-II Fluorescence in a Multilayer Nanoprobe for Through-Skull Mouse Brain Imaging. ACS Appl Mater Interfaces 2022, 14 (34), 38575-38583.

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