本文要點：熒光引導手術需要近紅外熒光團的發展。吲哚菁綠(ICG)應用廣泛，臨床記錄安全，但其在780 nm處的zui大吸收波長較短，因此需要利用較長波長的染料來發揮其低光毒性和深滲透的優點。在這里，作者團隊報道了一種穩定的深近紅外(NIR)熒光染色支架ECY，它在CH2Cl2中吸收/發射836/871 nm，熒光量子產率為16%。對ECY進行了更合理的生物分布的特異性設計。合成了類似的含不同數目的磺酸基或聚乙二醇鏈。通過對BALB/c小鼠靜脈注射的重點文庫進行篩選，發現ECYS2是肝膽排泄器官生物成像的合適候選者，ECYPEG是血管成像的zui 好的候選者。它們在術中成像中具有一定潛力。ECY是一種在836 nm處吸收的明亮熒光團，量子產率為16%，具有超光穩定性。其對肝臟、膽囊、膽管或腸道的生物分布特異性已通過分子工程實現。近紅外二區小動物活體成像系統 - MARS

生物成像光譜區域正向較長波長的方向轉變。對于小動物的體內成像或術中成像，組織穿透深度是首要考慮的問題。為了避免背景組織被血紅蛋白和含氧血紅蛋白吸收，要求在650 nm以上的光下進行實驗。穿透深度進一步受到組織散射的限制，其與波長的四次方成反比。目前的基準近紅外熒光團是Indocyanine Green (ICG)。它已廣泛應用于臨床背景下的眼底血管造影術、肝功能評估和熒光引導手術。體內成像需要深入到超過800 nm的長波長區域，即深近紅外。對于這種深近紅外光譜區域，需要一種多功能、明亮、生物相容性和生物分布特異性的熒光團。

近紅外活性物質種類繁多，有機熒光團因其較高的臨床轉譯潛力尤其受歡迎。ICG所屬的聚甲基花菁是20世紀30年代首ci報道的最著ming的一類長波長染料。它們在有機溶劑中表現出較窄的吸收帶和較高的摩爾吸光度。然而，花菁，特別是吸收波長超過800 nm的花菁，越來越容易發生極性/聚集誘導的對稱性破壞，從而導致其S0-S1吸收帶的峰移、帶寬和低色移。這些光譜變化即使不阻止高對比度多路復用的潛力，也會使其復雜化。

DAD/ADA型熒光染色支架是近紅外染料家族的新成員。它們的吸收帶通常較寬(FWHM > 100 nm)，摩爾吸光度較低。2017年，我們報道了一類新的近紅外熒光團，即EC5，其第yi個體現是在CH2Cl2中吸收880 nm的明亮深近紅外熒光團(ECX)。它的吸收強度高，吸收銳利，其吸收/發射zui大值受溶劑化變色的影響最小。多年來，808 nm激光線在近紅外生物成像中越來越受歡迎，而ECX在808 nm的吸收是最小的(圖1)。

為了解決這個問題，作者團隊計劃開發一種易于被808 nm激發的EC5衍生物。由于顯像劑的結構/生化特異性是外科醫生最關心的問題，因此需要對其生物分布進行系統研究。生物相容性是體內成像的另一個至關重要的參數。理想情況下，它需要是水溶性的，易于代謝/排泄，毒性最小。

圖1（ICG和ECX的吸收光譜顯示它們在830 nm處不明顯吸收，以及ECY的通用結構）

在這項工作中，作者團隊設計并合成了一種在CH2Cl2中吸收836nm的明亮熒光團ECY。為了得到ECY的水溶性類似物，作者團隊進一步安裝了不同數量的磺酸基，即不含ECYa，含1個ECYS1，含2個ECYS2，含3個ECYS3，或平均分子量為5000 amu的聚乙二醇鏈，即ECYPEG。評價了它們的光物理性質和激發態動力學、穩定性、急性毒性、代謝和生物分布。最后，作者團隊研究了它們在體內生物成像中的可行性。

隨著n-取代基給電子能力的降低，羅丹明染料的波長會發生藍移。因此，作者團隊將ECX的juloliine取代基改為二乙胺，從而得到了具有藍移波長的染料ECY。ECY的合成方法與ECX類似(方案1)。

方案1：ECYa-d及其水溶性類似物（ECYS1，ECYS2，ECYS3，ECYPEG）的合成過程。

在不同溶劑中檢測了它們的光譜特性(圖2和表1)。ECYa在CH2Cl2中的吸收光譜是典型的聚甲基花菁，在836 nm處有一個主波段，在752 nm處有一個肩帶(圖a)。它在380 - 780 nm的整個可見范圍內的吸收很弱，在556 nm、516 nm和470 nm處有三個峰指。激發后，ECYa在871 nm處發射zui大(Φ?16%)，在914 nm處有尾峰。ECYa的光譜性質表現為溶劑致變色，但程度不顯著。其吸收zui大值在甲苯中藍移822 nm，在CH3CN中藍移829 nm，在DMSO中紅移852 nm，在中性磷酸鹽緩沖液(PBS, 10 mmol/L, pH 7.4，含10% DMSO)中紅移846 nm。ECYS1的水溶性實際上比ECYa差，而ECYS2和ECYS3具有較高的水溶性(> 10 mg/mL)。之后獲得了ECYS1在CH2Cl2、ECYS2和ECYS3在HEPES緩沖溶液(10 mmol/L, pH 7.4, 0.1% DMSO)中的光譜(表1)。

圖2.紫外-可見吸收，（A）ECYa，（B）ECYS1，（C）ECYS2，（D）ECYS3，（E）ECYPEG的熒光發射光譜。它們的化學結構以插圖形式包括在內。這些吸收和發射光譜被進一步去卷積，組成帶被繪制在相應的光譜下方。ECYa和ECYS1溶解在CH2Cl2，ECYS2，ECYS3和ECYPEG溶解在HEPES緩沖液中。（F）ECYa在CH2Cl2和水介質中的吸收光譜比較。

表1

總的來說，它們的吸收光譜保持了菁的特征，與ECYa的吸收光譜基本相似。觀察到約10 nm的輕微峰移和約160 cm2 /15 nm的帶寬。溶劑致變色的不顯著性歸因于這樣一個事實，即磺酸基安裝在二苯醚或底部苯基上，它們在電子上與熒光致變色核心正交。

ECYPEG在HEPES中具有高水溶性，在851 nm處吸收，在890 nm處釋放。根據之前報道的方法，將CH2Cl2中ECYa的光譜擬合到由8個構成高斯峰的數學模型中，即a1, a2, a3, a4, a5, a6, a7和a8的zui大波長遞減。在較長光譜區域(700-900 nm)的峰a1, a2, a3和a4可能是從zui低振動水平S0到較高振動水平S1的HOMO-LUMO躍遷。在350-700 nm波長較短的區域，從較低的已占軌道到LUMO軌道的躍遷，共識別出a5、a6、a7和a8四個波段?；ㄝ既玖媳憩F出一個尖銳而強烈的主帶和一個不那么尖銳和低強度的肩帶。以ECYa為例，這兩個峰分別為a1和a3，FWHM′分別為689 cm-1和1022 cm-1。作者認為，四個波段(a1:a2:a3:a4)的振子強度(f)對整個光譜的貢獻百分比可以作為評價染料的一個可行的定量指標。

ECYa的花菁度為63:4:14:2。當溶解在HEPES (10 mmol/L, pH 7.4，添加0.5% ten -80)中，ECYa的花菁光譜特征保持不變，但峰a1和a3都略有變寬，FWHM分別為854 cm-1和1247 cm-1(圖F)。在58:5:21:4時，四個波段的貢獻百分比基本相同。ECYS1在CH2Cl2、ECYS2、ECYS3和ECYPEG在HEPES中的吸收光譜(圖2)B-E)同樣是反卷積的。a1波段寬度分別為701 cm- 1,850 cm- 1,845 cm-1和858 cm-1，貢獻率分別為62%、54%、55%和58%。

用自制的帶有近紅外CCD相機的外顯熒光顯微鏡對這些ECY染料的光穩定性進行了評估。將ECYS2/ECYS3/ECYPEG/ICG溶液分別置于含10%血清的PBS中，滴在玻片上，用蓋玻片密封。在808 nm激光激發下，用長通濾波器在850 nm處獲得ICG/ECYS2/ECYS3/ECYPEG的熒光強度。ICG的熒光強度在幾秒鐘內下降了約79.6%，而ECYPEG沒有表現出明顯的漂白。無論它們的頭基和取代基如何，都表現出良好的光穩定性。由于ECYS1的水溶性較差，因此未測試其光穩定性。

圖3.ECYS2、ECYS3、ECYPEG 和 ICG 在含有10%血清的PBS中的光穩定性研究，通過連續808nm激光照射密封在載玻片和蓋玻片之間的溶液進行。

作者團隊篩選了用于生物分布的不同取代的ECY染料的聚焦庫，即ECYa，ECYS2，ECYS3，劑量為1mg / kg和ECYPEG，劑量為3mg / kg。ICG常規用于手術中的脈管系統成像，并用作參考。然而，其快速的肝膽清除是一個實際的限制。在作者的實驗中，ICG（1mg / kg）通過尾靜脈注射到BALB / c小鼠中。用808nm的激光照射小鼠，并通過截止波長為1200nm的長波通濾光片收集熒光發射。在短短2分鐘內，肝臟的信號強度已經比頦下靜脈高1.7倍，比右大隱脈管系統高3.5倍。在1小時內，脈管系統中ICG的發射不再明顯。在接下來的幾個小時里，小強度和盲腸依次亮起，突出了其肝膽清除途徑和通過糞便排泄。通過監測肝臟和后肢脈管系統中ICG的熒光強度，計算出血液循環和肝膽清除率的半衰期分別為6.4±0.2分鐘和144.3±14.9分鐘。尾靜脈注射ECYa，ECYS3和ECYPEG時也清楚地觀察到小鼠脈管系統，但ECYS2除外，因為它的肝臟攝取快。與ICG相比，ECYa（1mg / kg）表現出改善的血液潴留，這在前兩小時內拍攝的圖像中很明顯（圖4A）。來自脾臟的信號強度變強，包括胸骨和脛骨在內的骨骼也被點亮，可能是由于免疫原性相互作用。在12小時內，在肝臟，腸道和脊柱中仍然可以看到排放。其血液保留半衰期為35.6±7.7分鐘。發現排泄主要通過網狀內皮系統，排泄半衰期為789.8±93.5分鐘，是整個系列研究中最慢的。ECYS2（1mg / kg）的生物學分布和藥代動力學與ICG相似，即肝臟快速攝取，血液保留半衰期短，為2.4±0.7分鐘，排泄快。

一個有趣的發現是，在注射后2-4小時內，膽囊與周圍組織形成高對比度染色。因此，它還顯示出在肝移植期間進行術中膽管造影以避免膽管醫源性損傷的潛力。與其他幾種染料相比，ECYS3（1 mg / kg）在qian10分鐘內產生最亮的脈管系統信號強度。然而，由于兩個原因，它不是一個好的候選人。首先，它的生物清除速度很快，甚至比ICG還要快。其次，它表現出意想不到的皮膚親和力，這解釋了更明亮的信號強度。來自皮膚的強烈信號實際上使深部組織脈管系統的觀察變得困難。ECYS3的血液循環時間為18.6±1.4 min，肝臟吸收后排泄更快，排泄半衰期為60.5±10.9分鐘。ECYPEG（3 mg/kg）表現出強大的脈管成像能力。在前2分鐘內，ECYPEG點亮了精神下，腹部和后肢脈管系統等，肝臟攝取程度相對較低，其中平均信號僅比1.9倍強右隱脈管系統的比率分別為3.5、3.3、7.4和1.9。在接下來的3 h中，盡管腦和后肢脈管系統中的信號強度逐漸降低，但突出顯示的血管的信噪比（SBR）保持在zui大值的一半以上，而注射ICG后幾乎沒有熒光信號可見。計算血液保留半衰期為147.5±34.8分鐘，排泄半衰期為244.1±19.7分鐘。

圖 4.（A）在不同時間點用808nm激光線（1200nm長通濾光片，50ms）靜脈注射ICG，ECYa，ECYS2，ECYS3和ECYPEG后仰臥位小鼠的NIR熒光成像。（B,C）ICG，ECYa，ECYS2，ECYS3和ECYPEG給藥小鼠肝臟和右隱脈管系統的代表性熒光強度作為時間的函數。（D）清醒小鼠的呼吸頻率（每分鐘170次呼吸），通過檢測靜脈注射ECYPEG（1100nm長通濾光片，5ms）后肝臟運動的熒光信號波動進行分析。所有圖像均使用808 nm激光線（150 mW/cm）獲得。

通過比較肝臟中的熒光強度，親脂性ECYa的代謝和排泄最慢，ECYPEG的代謝和排泄速度第二慢（圖4B）。所有磺酸鹽衍生化類似物的代謝速度都快于ICG。為了比較它們的血液保留，外推后肢脈管系統的熒光強度（圖4C）。ECYPEG是最持久的。其信號在注射后的前30分鐘內逐漸增加，然后在ca內保持穩定。隨后緩慢下降前30分鐘。ECYPEG用于通過視頻速率成像監測小鼠呼吸（圖4D）。計算呼吸頻率為170次呼吸/分鐘。研究了ECY染料的細胞活力，并且所有染料的細胞毒性都可以忽略不計。zui有希望的候選者（ECYPEG）和次佳候選者（ECYa）被送去用小鼠進行急性毒性研究。發現ECYPEG在高達200mg / kg的zui高測試劑量下沒有表現出急性毒性，而LD50ECYa的14.7±1.8毫克/千克。ECYPEG的生物相容性進一步證明了良好的肝功能和器官組織學。根據血液保留半衰期、肝膽清除半衰期和生物相容性，選擇ECYPEG進行進一步研究。

作者團隊進一步優化了ECYPEG更高SBR的成像參數，同時展示了肢體和大腦中更細血管的概念驗證脈管系統成像。將ECYPEG靜脈注射到小鼠尾部，在808 nm激光線激發下，用不同截止波長的長波通發射濾光片收集熒光信號。使用1000 nm的長波通和1100 nm（1 ms），（5 ms），1200 nm（20 ms），1300 nm（50 ms），1400 nm（300 ms），1500 nm（600 ms）的曝光時間獲取了一系列圖像（圖5A）。一個普遍的趨勢是，更長的截止波長導致較少的組織散射程度，改善SBR（圖5D）和空間分辨率，但以犧牲曝光時間為代價。在后肢脈管系統的成像過程中也發現了相同的趨勢（圖5 B-E），其中可以明顯觀察到FWHM為71.1μm的血管（圖H）。曝光時間和SBR之間的折衷導致確定為1300 nm / 50 ms用于未來的成像研究。

圖5.通過尾靜脈注射ECYPEG對BALB / C小鼠進行體內成像。（A）全身成像，依次用1000、1100、1200、1300、1400、1500nm的長波通發射濾光片進行。比例尺：1厘米。（B）用1150、1250、1350和1450nm的長波通濾光片對后肢血管進行熒光成像。比例尺：2毫米。（C）使用1350 nm長波通濾光片進行腦脈管系統成像。比例尺：分別為 2 毫米、1 毫米、0.5 毫米。（D）圖中突出顯示的腹部（綠線）和后肢（紅線）血管的信噪比（SBR）。5A.（E）圖5B中突出顯示的血管的SBR （F，G） 圖5C1-C2中脈管系統沿藍線的相應SBR。（H）橫截面熒光強度分布（黑點）和高斯在圖 5C3 中適合其直徑的紅線。所有圖像均使用808 nm激光線（120 mW/cm2）

討論：作者團隊進一步使用 ECYPEG 從上視圖對大腦脈管統的微小血管通過完整的顱骨進行成像，激發波長為 808 nm，長通截止波長為 1350 nm，曝光時間為 100 ms，放大倍率為 0.64。靜脈注射ECYPEG（3mg/kg）后，可以清楚地區分與SSS相連的腦下靜脈（ICV）、橫竇（TS）、上矢狀竇（SSS）和淺靜脈（SV）。較短的曝光有利于高成像幀速率，而較長的曝光時間可改善SBR。例如，為了實現更豐富的脈管系統網絡觀察，曝光時間設置為500毫秒。在100 ms的曝光下，通過兩個毛細管的線輪廓（以藍色突出顯示，圖5C），計算出SBR為1.11和1.16（圖5F）。通過增加到500 ms，獲得1.22和1.26的SBR（圖5G）。3倍的更高放大倍率和500毫秒的曝光時間提供了更高的空間分辨率。用良好的SBR觀察到表觀寬度僅為6.3μm的微血管（圖5）。

綜上所述，作者團隊在CH2Cl2中開發了一種明亮的深近紅外熒光團(ECY)，吸收/發射波長為836 nm, FWHM窄至689 cm-1。通過引入不同數量的磺酸鹽(ECYS1、ECYS2和ECYS3)或聚乙二醇鏈(ECYPEG)，作者團隊進一步合成了一個ECY水溶性的集中庫。在活體小鼠成像中進行了測試。ECYS2具有肝膽代謝器官成像的潛力，ECYPEG具有血管成像的潛力。這項工作為未來發展用于深近紅外多路復用的熒光團提供了一個框架。此外，該工作的熒光團在基礎研究、轉化醫學和外科手術中具有廣泛的實際應用潛力。

參考文獻

Dong, Y.; Lu, X.; Li, Y.; Chen, W.; Yin, L.; Zhao, J.; Hu, X.; Li, X.; Lei, Z.; Wu, Y.; Chen, H.; Luo, X.; Qian, X.; Yang, Y., Spectral and biodistributional engineering of deep near-infrared chromophore. Chinese Chemical Letters 2023.

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