本文要點：近紅外二區 (NIR-II) 染料可以被外源性或內源性白蛋白包裹，形成用于深部組織生物成像的穩定復合物。本文確定了控制花菁染料與白蛋白超分子/共價結合的幾個關鍵參數：含Cl的六元環、小尺寸側鏈和相對較高的疏水性。設計的熒光團(IR-780@albumin) 具有顯著增強的光穩定性，可作為 NIR-II生物成像的長效成像探針。本文研究表明，含氯花菁染料（例如 IR-780）可以更有效地嵌入白蛋白中，從而產生更穩定的熒光探針。這一發現部分解決了臨床上可用的花菁染料的光漂白問題，豐富了 NIR-II生物成像和手術導航的探針庫。

先前研究已經證明了含氯花菁染料和白蛋白之間通過共價鍵結合。然而，目前仍然缺乏對結合機制的詳細研究來指導穩定探針的形成。

作者首先篩選了一個與白蛋白結合的花菁染料庫，并在測試了亮度增強效應。如Figure 1B所示，通過比較在DMSO、PBS和BSA中的9種染料的亮度，發現花菁染料@BSA與在DMSO中相比可以恢復部分亮度，而在PBS中由于ACQ效應而聚集淬滅。IR-783@BSA、IR-808@BSA和 IR-780@BSA與其他染料相比具有更高的熒光增強（Figure 1C）。接著優化了染料和 BSA 的摩爾比，1：1結合有zui 家的亮度增強效果（Figure 1D）。IR-780@BSA 光穩定性顯著提高，在 NIR-II窗口下半衰期超過25 min （Figure 1E）。IR-780@BSA 的紅移和熒光增強可能是受限扭曲分子內電荷轉移(TICT)的影響（Figure 1F&G）。

高濃度的花菁染料@BSA對激光的耐受性更高（Figure 2A&B），其中IR-780@BSA在所有反應濃度下都比IR-783@BSA更穩定。作者進一步選擇了三種組合：花菁:BSA = 1:1（100μM）；花菁:BSA = 2:1（100μM）；花菁:BSA = 1:1（200μM），比較了亮度衰減的時間點（t）和亮度（B），結論是光穩定性主要由花菁@BSA的濃度決定，過量的花菁會淬滅花菁@BSA的亮度并延長亮度衰減的時間點。

接下來探索了花菁@BSA體系的光穩定性，在模擬血液環境下，體系濃度為10 ~ 400μM（Figure 2C，Group 1,2）。當花菁與蛋白質比例小于1時，PBS和BSA中的光穩定性趨勢相似，表明當花菁與BSA完quan結合時，花菁@BSA熒光團不受緩沖液環境的影響（Figure 2C，中間）。摩爾比>1的花菁@BSA體系中，游離花菁可以淬滅熒光團亮度，而純花菁@BSA可以保持初始亮度（Figure 2C，右）。因此，BSA緩沖液可以通過與游離花菁結合而提高花菁@BSA體系（摩爾比 >1）的亮度。

稀釋后（Group 1）和10μM 花菁@BSA體系（Group 3）之間的相似趨勢證明，濃度可以影響光穩定性但不改變結合性質。對于摩爾比>1的花菁@BSA體系，BSA緩沖液稀釋（Group 2）比PBS（Group 1）以及10μM反應體系（Group 3）中更具光穩定性。此外，IR-780在不同濃度BSA中的吸收和發射光譜表明，亮度主要由IR-780和BSA之間的相互作用主導。雖然峰值發射（800?850 nm）隨著BSA的增加而增加，但當BSA:IR-780 > 1時，超過850 nm的尾部發射強度是等效的（Figure 2D）。作者還比較了高濃度 (400μM)花菁@BSA被PBS稀釋前后的亮度（Figure 2E）。

進一步研究了IR-780/IR-783與BSA結構域 I (DI)、結構域 II (DII) 和結構域 III (DIII) 之間的結合能力。Figure 3A&C所示，花菁@DIII比花菁@DI和花菁@DII亮得多。從電泳結果 (Figure 3B, D) 來看, DI和DIII都可以有效地與花菁染料形成共價鍵。室溫下在較短的反應時間里，含氯化物的花菁染料也可以與 DIII 共價結合，而與DI共價結合需要更長的反應時間。然而，共價結合并沒有提高染料@DI的亮度。從光譜數據（Figure 1F、G ）來看，DI和DIII表現出與BSA相同的促進吸收峰紅移的效果，但只有DIII同時增強了吸收和發射強度。

為了準確理解花菁與白蛋白或白蛋白片段之間的作用機制，作者利用商業化花菁染料（ICG, IRdye800CW, IR-775, IR-780, IR-783, IR-797, IR-806, IR-808, and IR-820）系統分析。比較九組花菁@蛋白的亮度數據（Figure 4A），亮度的增強并不依賴共價結合。Figure 4C表明DIII是主要的結合位點，DI使第二結合位點。花菁與蛋白之間有效的超分子作用的對于穩定TICT至關重要，因此增量了NIR-II亮度。Figure 4B電泳分析結果表明，含氯環己烯基團的花菁（IR-775, IR-780, IR-783, IR-808）和BSA，HAS，DIII有完整的相互作用，而IR-820是個特例。因此，作者合理推測萘的空間位阻阻擋了IR-820與血清蛋白之間的接觸，從而降低了有xian時間內共價結合程度。IR-820與DIII的相互作用程度較高證實了這一假設。

此外，電泳結果發現不含Cl的染料（IRdye800CW，ICG）沒有觀察到與蛋白的結合。基于這一點，作者假設位阻和親水性阻止了有效的超分子作用。ICG與BSA、HAS結合后亮度增強，但與結構域結合沒有明顯變化。這進一步表明，整個白蛋白的疏水口袋對于錨定含氯和不含氯的染料都是bi不可少的，而 DIII 需要共價結合才能有效地“鉤住"含氯染料。然后比較了含Cl染料，包括五元環 (IR-797, IR-806) 和六元環 (IR-775, IR-783)。結果發現花菁染料與五元環 (IR-797, IR-806)僅形成部分共價結合。

作者進行了分子對接，并用長時間分子動力學模擬（MD）確認了染料與BSA之間理想的結合模式（Figure 5）。如Figure 5所示，IR-783@BSA與IR-808@BSA的結合位點相同，但是IR-780@BSA不同，它有一個更緊的口袋，這意味著更強的結合。三個探針的相對結合自由能分別是-47.56, -42.13, and -36.14 kcal/mol，這與實驗觀察一致。

作者分析了探針的基礎代謝（Figure 6A-D）。靜脈注射IR-780@BSA后，探針快速積累在肝臟，然后在全身分布，隨后糞便排泄，與游離IR-780的肝膽代謝方式相同（Figure 6A&B）。然后評估了IR-780@DI和IR-780@DIII的體內行為。由于尺寸較小，這兩種結構域衍生的探針都表現出腎臟排泄途徑（Figure 6C、D）。盡管 IR-780@DI和IR-780@DIII給藥小鼠的腎臟信號沒有太大差異，但IR-780@DIII 的腎臟與皮膚比值在24~96 h內更為顯著（Figure 6F）。隨后追蹤了不同花菁@BSA的體內行為，并證明探針的代謝行為與共價鍵合的程度有關。不含Cl 花菁@血清蛋白顯示出快速的肝膽消除，與游離染料類似。含Cl 花菁@血清蛋白的代謝時間與光穩定性結果一致（Figure 6B）。體內代謝行為可以間接反映花菁@BSA的光穩定性特征。

最后進行淋巴結成像以評估NIR-II成像能力。使用三種花菁@BSA（IR-780@BSA，IR-808@BSA，IR-783@ BSA）和臨床使用的ICG研究了淋巴結成像的光穩定性。IR-780@BSA在四個測試探針中仍然zui穩定（Figure 6G）。IR-780@BSA（1 mM，25 μL）為腘窩淋巴結可視化提供了穩定的NIR-II成像，并且在長達60 min的連續激光照射中沒有觀察到信號衰減（Figure 6G）。在左腳掌注射IR-780@BSA以及右側注射ICG，腘窩和骶骨淋巴結在俯臥位清晰地勾勒出來。成像時間測試長達6小時（淋巴結與皮膚比值≥3.6），滿足了長時間成像導航手術（Figure 6H，I）。

參考文獻

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近紅外二區小動物活體熒光成像系統 - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優于3um

熒光壽命 - 分辨率優于 5us

高速采集 - 速度優于1000fps （幀每秒）

多模態系統 - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區高分辨顯微系統，兼容成像型光譜儀

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 恒光智影

          上海恒光智影醫療科技有限公司，專注于近紅外二區成像技術。致力于為生物醫學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供*的、一體化的成像解決方案。自主研發近紅外二區小動物活體熒光成像系統-MARS。

          與基于可見光波長的傳統成像技術相比，我們的技術側重于X射線、紫外、紅外、短波紅外、太赫茲范圍，可為腫瘤學、神經學、心血管、藥代動力學等一系列學科的科研人員提供清晰的成像效果，助力科技研發。

          同時，恒光智影還具備探針研發能力，我們已經成功研發了超過15種探針，這些探針將廣泛地應用于眾多生物科技前沿領域的相關研究中。