今天的蛋白組學研究中,研究人員們在轉(zhuǎn)化研究,生物標志物發(fā)現(xiàn),甚至單細胞分析等過程中,不止是追求簡單的鑒定,更多的需要獲取準確可靠的定量信息,用以理解生物學問題。 他們需要使用精確的定量檢測方法來表征生物系統(tǒng)之間的差異,對大量樣本進行高置信度、高通量的表征,驗證生物學假說。
在剛結(jié)束的USHUPO中,賽默飛正式推出了全新的Velocity LFQ DIA 工作流程。 該平臺基于Thermo Scientific Orbitrap 超高分辨質(zhì)譜儀、Thermo Scientific Vanquish NEO UHPLC 系統(tǒng)以及高效的 Thermo Scientific µPAC UHPLC 色譜柱技術(shù),具有優(yōu)異的定量性能,蛋白組深度覆蓋,并可輕松實現(xiàn)高通量分析,匹配今天研究人員們對定量蛋白組學研究的需求。 下面就由小編給大家介紹該平臺的工作流程,并展示其在定量表征、蛋白組覆蓋度和方法通量中的性能。
Workflow
Velocity LFQ DIA 工作流程
Velocity LFQ DIA 工作流程組成如圖1 所示,包括Vanquish Neo UHPLC 系統(tǒng)和µPAC Neo UHPLC 色譜柱用于色譜分離,Easy-Spray 納升離子源和 Orbitrap Exploris 240/480 用于質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集,Spectronaut軟件用于數(shù)據(jù)分析。
圖1. Velocity LFQ DIA 工作流程示意圖
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色譜分離:
大隊列研究中需要有穩(wěn)健的色譜設(shè)置(分離技術(shù)、色譜柱等),確保系統(tǒng)長期穩(wěn)定運行。 Vanquish Neo UHPLC 系統(tǒng)可實現(xiàn)高重現(xiàn)性,并可進行多種類型的 LC-MS 實驗。 新的色譜分離技術(shù)同樣也可提高系統(tǒng)穩(wěn)健性,例如基于微陣列的 µPAC Neo 色譜柱,可提高分析靈敏度和保留時間穩(wěn)定性 [1] 。
質(zhì)譜分析:
除了穩(wěn)健性和重復(fù)性之外,可靠的鑒定和定量在蛋白組學研究中十分重要。 Orbitrap 技術(shù)可提供高質(zhì)量精度以及高分辨率,是復(fù)雜 DIA 掃描中可靠鑒定,以及準確、精確檢測并分辨離子類型的關(guān)鍵因素。
數(shù)據(jù)分析:
DIA譜圖中為混合母離子碎裂后所得的混合子離子譜圖,通常需要使用譜圖庫方法進行解析。 但是,隨著數(shù)據(jù)分析軟件(例如,使用機器學習方法模擬預(yù)測獲得高質(zhì)量的譜圖庫)的發(fā)展,無需譜圖庫的方法成為了節(jié)約時間和成本的一種選擇。
Key Words
Velocity LFQ DIA 工作流程三個關(guān)鍵詞:
定量、覆蓋度、通量
為了深入展示 Velocity LFQ DIA的性能,我們建立一個穩(wěn)健、高重現(xiàn)性的工作流程,可實現(xiàn)復(fù)雜樣品中蛋白的準確鑒定和定量。 其中使用了兩個不同的混合樣品,包括兩種蛋白組和三種蛋白組混合樣品(圖2),質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集使用OE240質(zhì)譜儀。
圖2. Velocity LFQ DIA 工作流程性能展示所使用的的實驗設(shè)計。 A,兩種蛋白組混合樣本,包括高含量的人類肽段背景(800 ng Hela 酶解肽段),低到中含量的 Ecoli肽段,比值為1:2:4:8; B,三種蛋白組混合樣本,中等含量的人類肽段背景(325 ng Hela 酶解肽段),以及酵母和Ecoli肽段,比值分別為1:0.5和1:4。 這些混合樣本分別模擬生物樣本中的上調(diào)和下調(diào)蛋白表達情況。 (點擊查看大圖)
01
出色的定量性能
分別對上述兩種樣本進行30min的LC-MS采樣,數(shù)據(jù)采用Spectronaut16,directDIA的方式進行數(shù)據(jù)分析,肽段和蛋白的FDR均小于1%。
Ecoli和hela的混合樣本中,ecoli蛋白在4個樣本中的3個不同比值均十分接近理論比值,且所有數(shù)據(jù)點在中位數(shù)附近分布很窄,展示了Velocity LFQ DIA工作流程的高定量準確性和精密度(圖3A)。 此外,技術(shù)重復(fù)間肽段的 CV 值均小于 7%(圖3B),說明該工作流程具有高定量精密度。
圖3. 工作流程的定量準確性和精密度展示,使用兩個蛋白組混合樣本。 A,Ecoli蛋白三個不同比值下的實際比值,以箱型圖展示,橙色虛線為理論比值; B,4個不同比例下肽段豐度CV的小提琴圖。 (點擊查看大圖)
同時,使用Velocity LFQ DIA工作流程可獲得約5個數(shù)量級的人類蛋白動態(tài)范圍(圖4A),有助于低豐度蛋白的發(fā)現(xiàn)。 在高含量的hela肽段背景下,使用該工作流程可發(fā)現(xiàn)很多細菌體內(nèi)的重要蛋白,包括與轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān),以及人類干擾素誘導相關(guān)的ecoli蛋白。 另外,選取了Ecoli中十個豐度最低的蛋白,發(fā)現(xiàn)它們在不同樣品間的實際比值依然十分接近理論比值(圖4B),說明該工作流程即使在低豐度蛋白情況下仍可獲得高定量準確性。
圖4. A,兩個蛋白組混合樣本的蛋白豐度分布; B,Ecoli中十個豐度最低蛋白的實際比值與理論比值偏差 (點擊查看大圖)
在三個蛋白組混合樣本中,Velocity LFQ DIA工作流程同樣展示了出色的定量性能。 實際比值與理論比值之前偏差<2%。 可定量約3000個人類蛋白,接近500個Ecoli蛋白(圖5A)。 樣本A與B的肽段豐度展現(xiàn)了與比值相一致的線性斜率,以及與物種相關(guān)的整體豐度范圍(圖5B)。
圖5. 工作流程的定量性能展示,使用三個蛋白組混合樣本。 A,三個蛋白組不同比值下的實際比值,以箱型圖展示,橙色虛線為理論比值; B,樣本A與B的肽段豐度相關(guān)性。 (點擊查看大圖)
02
深度蛋白組覆蓋
使用Spectronaut16的directDIA方法分析兩個蛋白組樣品,在不損失定量性能的同時,可獲得深度蛋白組覆蓋。 然后使用第三方軟件DIA-NN [2] 分析相同的數(shù)據(jù)集,可獲得與sp16類似的結(jié)果。 當使用Spectronaut17軟件時,改善的directDIA+方法可提高30%的母離子鑒定,及10%的蛋白鑒定(圖6),30min梯度內(nèi),不使用譜圖庫可獲得接近7000個蛋白鑒定。 這表明Velocity LFQ DIA工作流程不僅可獲得出色的定量性能,也可實現(xiàn)深度蛋白組覆蓋,此外也說明了不使用譜圖庫可作為一種有效的DIA數(shù)據(jù)分析方法。 如果想進一步提高蛋白組覆蓋深度,也可通過建立合適譜圖庫的方法實現(xiàn)。
圖6. 使用library free方法分析兩個蛋白組樣品可實現(xiàn)深度蛋白組覆蓋。 柱狀圖比較了三個不同的軟件(或版本)所得的蛋白和母離子數(shù)目,FDR<1%。 (點擊查看大圖)
03
高通量流程
在上述所展示的Velocity LFQ DIA工作流程中,有效梯度為30min,實際時長為每針39min,可提供每天分析 36個樣品的通量。 另外,在一些大隊列研究中,研究人員需要更高的分析通量。 在Velocity LFQ DIA工作流程中使用了Vanquish Neo液相,其使用靈活,且經(jīng)過優(yōu)化樣品吸取、上樣、色譜柱清洗和平衡等流程,可有效提高質(zhì)譜利用率 [3] ,可方便研究人員根據(jù)項目需求,進一步提高樣品通量。
04
工作流程穩(wěn)健性
為了驗證Velocity LFQ DIA工作流程的穩(wěn)健性,從一個持續(xù)兩個月時間(使用同一根色譜柱)的項目中選取其中的一部分數(shù)據(jù)作為展示。 采用 200 ng Hela肽段,DDA實驗作為系統(tǒng)性能的 QC,在兩個月內(nèi)間歇運行,梯度為67min,結(jié)果如圖7所示。 由結(jié)果可知,肽段和蛋白的鑒定數(shù)字在整個500小時的項目中(總上樣量約為130 µg)保持一致(鑒定數(shù)字變化在5%以內(nèi))。 這說明了色譜柱,色譜分離以及質(zhì)譜的穩(wěn)健性,這對大隊列研究十分重要,是獲得良好數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)。
圖7. 兩個月的使用時間內(nèi),肽段和蛋白鑒定的重現(xiàn)性。 在整個實驗周期中,間歇運行DDA QC實驗,數(shù)據(jù)分析使用CHIMERYS算法。 (點擊查看大圖)
小結(jié)
Velocity LFQ DIA工作流程結(jié)合了 Vanquish Neo 系統(tǒng),µPAC Neo色譜柱以及 Orbitrap 超高分辨質(zhì)譜儀,是高通量非標蛋白組DIA鑒定和定量的一種理想工作流程。
采用30min梯度的OE240方法展示了該工作流程的主要性能特點: 出色的定量深性能、蛋白組深度覆蓋和分析高通量。
Velocity LFQ DIA工作流程適用于需要高通量、穩(wěn)健性、高準確性精密度定量性能和深度蛋白組覆蓋的定量蛋白組學研究。
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