今天的蛋白組學研究中，研究人員們在轉化研究，生物標志物發現，甚至單細胞分析等過程中，不止是追求簡單的鑒定，更多的需要獲取準確可靠的定量信息，用以理解生物學問題。 他們需要使用精確的定量檢測方法來表征生物系統之間的差異，對大量樣本進行高置信度、高通量的表征，驗證生物學假說。
在剛結束的USHUPO中，賽默飛正式推出了全新的Velocity LFQ DIA 工作流程。 該平臺基于Thermo Scientific Orbitrap 超高分辨質譜儀、Thermo Scientific Vanquish NEO UHPLC 系統以及高效的 Thermo Scientific µPAC UHPLC 色譜柱技術，具有優異的定量性能，蛋白組深度覆蓋，并可輕松實現高通量分析，匹配今天研究人員們對定量蛋白組學研究的需求。 下面就由小編給大家介紹該平臺的工作流程，并展示其在定量表征、蛋白組覆蓋度和方法通量中的性能。
Workflow
Velocity LFQ DIA 工作流程
Velocity LFQ DIA 工作流程組成如圖1 所示，包括Vanquish Neo UHPLC 系統和µPAC Neo UHPLC 色譜柱用于色譜分離，Easy-Spray 納升離子源和 Orbitrap Exploris 240/480 用于質譜數據采集，Spectronaut軟件用于數據分析。
圖1. Velocity LFQ DIA 工作流程示意圖
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色譜分離：
大隊列研究中需要有穩健的色譜設置（分離技術、色譜柱等），確保系統長期穩定運行。 Vanquish Neo UHPLC 系統可實現高重現性，并可進行多種類型的 LC-MS 實驗。 新的色譜分離技術同樣也可提高系統穩健性，例如基于微陣列的 µPAC Neo 色譜柱，可提高分析靈敏度和保留時間穩定性 [1] 。
質譜分析：
除了穩健性和重復性之外，可靠的鑒定和定量在蛋白組學研究中十分重要。 Orbitrap 技術可提供高質量精度以及高分辨率，是復雜 DIA 掃描中可靠鑒定，以及準確、精確檢測并分辨離子類型的關鍵因素。
數據分析：
DIA譜圖中為混合母離子碎裂后所得的混合子離子譜圖，通常需要使用譜圖庫方法進行解析。 但是，隨著數據分析軟件（例如，使用機器學習方法模擬預測獲得高質量的譜圖庫）的發展，無需譜圖庫的方法成為了節約時間和成本的一種選擇。
Key Words
Velocity LFQ DIA 工作流程三個關鍵詞：
定量、覆蓋度、通量
為了深入展示 Velocity LFQ DIA的性能，我們建立一個穩健、高重現性的工作流程，可實現復雜樣品中蛋白的準確鑒定和定量。 其中使用了兩個不同的混合樣品，包括兩種蛋白組和三種蛋白組混合樣品（圖2），質譜數據采集使用OE240質譜儀。
圖2. Velocity LFQ DIA 工作流程性能展示所使用的的實驗設計。 A，兩種蛋白組混合樣本，包括高含量的人類肽段背景（800 ng Hela 酶解肽段），低到中含量的 Ecoli肽段，比值為1:2:4:8； B，三種蛋白組混合樣本，中等含量的人類肽段背景（325 ng Hela 酶解肽段），以及酵母和Ecoli肽段，比值分別為1:0.5和1:4。 這些混合樣本分別模擬生物樣本中的上調和下調蛋白表達情況。 （點擊查看大圖）
01
出色的定量性能
分別對上述兩種樣本進行30min的LC-MS采樣，數據采用Spectronaut16，directDIA的方式進行數據分析，肽段和蛋白的FDR均小于1%。
Ecoli和hela的混合樣本中，ecoli蛋白在4個樣本中的3個不同比值均十分接近理論比值，且所有數據點在中位數附近分布很窄，展示了Velocity LFQ DIA工作流程的高定量準確性和精密度（圖3A）。 此外，技術重復間肽段的 CV 值均小于 7%（圖3B），說明該工作流程具有高定量精密度。
圖3. 工作流程的定量準確性和精密度展示，使用兩個蛋白組混合樣本。 A，Ecoli蛋白三個不同比值下的實際比值，以箱型圖展示，橙色虛線為理論比值； B，4個不同比例下肽段豐度CV的小提琴圖。 （點擊查看大圖）
同時，使用Velocity LFQ DIA工作流程可獲得約5個數量級的人類蛋白動態范圍（圖4A），有助于低豐度蛋白的發現。 在高含量的hela肽段背景下，使用該工作流程可發現很多細菌體內的重要蛋白，包括與轉錄翻譯相關，以及人類干擾素誘導相關的ecoli蛋白。 另外，選取了Ecoli中十個豐度最低的蛋白，發現它們在不同樣品間的實際比值依然十分接近理論比值（圖4B），說明該工作流程即使在低豐度蛋白情況下仍可獲得高定量準確性。
圖4. A，兩個蛋白組混合樣本的蛋白豐度分布； B，Ecoli中十個豐度最低蛋白的實際比值與理論比值偏差 （點擊查看大圖）
在三個蛋白組混合樣本中，Velocity LFQ DIA工作流程同樣展示了出色的定量性能。 實際比值與理論比值之前偏差<2%。 可定量約3000個人類蛋白，接近500個Ecoli蛋白（圖5A）。 樣本A與B的肽段豐度展現了與比值相一致的線性斜率，以及與物種相關的整體豐度范圍（圖5B）。
圖5. 工作流程的定量性能展示，使用三個蛋白組混合樣本。 A，三個蛋白組不同比值下的實際比值，以箱型圖展示，橙色虛線為理論比值； B，樣本A與B的肽段豐度相關性。 （點擊查看大圖）
02
深度蛋白組覆蓋
使用Spectronaut16的directDIA方法分析兩個蛋白組樣品，在不損失定量性能的同時，可獲得深度蛋白組覆蓋。 然后使用第三方軟件DIA-NN [2] 分析相同的數據集，可獲得與sp16類似的結果。 當使用Spectronaut17軟件時，改善的directDIA+方法可提高30%的母離子鑒定，及10%的蛋白鑒定（圖6），30min梯度內，不使用譜圖庫可獲得接近7000個蛋白鑒定。 這表明Velocity LFQ DIA工作流程不僅可獲得出色的定量性能，也可實現深度蛋白組覆蓋，此外也說明了不使用譜圖庫可作為一種有效的DIA數據分析方法。 如果想進一步提高蛋白組覆蓋深度，也可通過建立合適譜圖庫的方法實現。
圖6. 使用library free方法分析兩個蛋白組樣品可實現深度蛋白組覆蓋。 柱狀圖比較了三個不同的軟件（或版本）所得的蛋白和母離子數目，FDR<1%。 （點擊查看大圖）
03
高通量流程
在上述所展示的Velocity LFQ DIA工作流程中，有效梯度為30min，實際時長為每針39min，可提供每天分析 36個樣品的通量。 另外，在一些大隊列研究中，研究人員需要更高的分析通量。 在Velocity LFQ DIA工作流程中使用了Vanquish Neo液相，其使用靈活，且經過優化樣品吸取、上樣、色譜柱清洗和平衡等流程，可有效提高質譜利用率 [3] ，可方便研究人員根據項目需求，進一步提高樣品通量。
04
工作流程穩健性
為了驗證Velocity LFQ DIA工作流程的穩健性，從一個持續兩個月時間（使用同一根色譜柱）的項目中選取其中的一部分數據作為展示。 采用 200 ng Hela肽段，DDA實驗作為系統性能的 QC，在兩個月內間歇運行，梯度為67min，結果如圖7所示。 由結果可知，肽段和蛋白的鑒定數字在整個500小時的項目中（總上樣量約為130 µg）保持一致（鑒定數字變化在5%以內）。 這說明了色譜柱，色譜分離以及質譜的穩健性，這對大隊列研究十分重要，是獲得良好數據的基礎。
圖7. 兩個月的使用時間內，肽段和蛋白鑒定的重現性。 在整個實驗周期中，間歇運行DDA QC實驗，數據分析使用CHIMERYS算法。 （點擊查看大圖）
小結
Velocity LFQ DIA工作流程結合了 Vanquish Neo 系統，µPAC Neo色譜柱以及 Orbitrap 超高分辨質譜儀，是高通量非標蛋白組DIA鑒定和定量的一種理想工作流程。
采用30min梯度的OE240方法展示了該工作流程的主要性能特點： 出色的定量深性能、蛋白組深度覆蓋和分析高通量。
Velocity LFQ DIA工作流程適用于需要高通量、穩健性、高準確性精密度定量性能和深度蛋白組覆蓋的定量蛋白組學研究。
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