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在上期內(nèi)容里簡要介紹了賽默飛Acclaim系列混合模式色譜柱的理化性質(zhì)、保留機制及典型應(yīng)用，那么這一期我們將進一步探討混合模式方法開發(fā)過程中的色譜柱選擇及色譜條件優(yōu)化細節(jié)。

混合模式方法開發(fā)的重點和難點，主要集中在色譜柱選擇、流動相選擇、檢測器選擇以及色譜條件優(yōu)化，接下來我們針對每一個細節(jié)進行探討，并總結(jié)一些經(jīng)驗及注意事項，為藥物色譜分析提供借鑒和參考。

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色譜柱的選擇

根據(jù)化合物的理化性質(zhì)，準確識別分子結(jié)構(gòu)的特征官能團，如苯環(huán)、烴鏈等的疏水官能團，羧酸、磺酸等酸性官能團，胺類、含氮雜環(huán)等堿性官能團，多羥基官能團（糖類），強極性化合物及陰陽離子。針對不同類型目標物，Acclaim系列混合模式色譜柱適用范圍，如表1所示：

具有反相保留的酸性化合物推薦色譜柱：Acclaim Mixed-Mode WAX-1，Acclaim Trinity P1；

具有反相保留的堿性化合物推薦色譜柱：Acclaim Mixed-Mode WCX-1，Acclaim Trinity P1；

具有多羥基結(jié)構(gòu)的中性化合物推薦色譜柱：Acclaim Mixed-Mode HILIC-1，Acclaim Trinity P2;

強極性化合物推薦色譜柱：Acclaim Trinity P1，Acclaim Trinity P2，Acclaim Trinity Q1；

活性藥物成分與對離子分析推薦色譜柱：Acclaim Trinity P1，Acclaim Trinity P2。

表1針對不同類型目標物，Acclaim系列混合模式色譜柱適用范圍匯總

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流動相的選擇

有機相：除Acclaim Mixed-Mode HILIC-1外，Acclaim系列混合模式色譜柱均涉及離子交換作用，基于洗脫強度及離子交換可控的考量，通常建議有機相使用非質(zhì)子溶劑——乙腈。對于 Acclaim Mixed-Mode WCX-1，Acclaim Trinity P2 和 Acclaim Trinity Q1具有弱陽離子交換（WCX）功能的色譜柱禁止使用醇類（甲醇、乙醇、異丙醇等）作為樣品溶劑或流動相，因為醇類在一定條件下會與羧酸官能團發(fā)生酯化反應(yīng)，導(dǎo)致保留時間漂移。Acclaim Mixed-Mode HILIC-1在分析聚乙二醇PEGs時，可使用甲醇作為有機相；Acclaim Surfactant Plus在分析吐溫-80時，可使用異丙醇作為有機相。

水相（緩沖鹽）： Acclaim系列混合模式色譜柱在活化、分析或保存的過程中，為避免因電荷無法中和而導(dǎo)致離子交換官能團出現(xiàn)坍塌，因此水相必須含緩沖鹽，通常建議使用甲酸銨、乙酸銨或磷酸緩沖鹽，緩沖鹽種類、濃度及pH調(diào)節(jié)，應(yīng)根據(jù)化合物理化性質(zhì)、檢測器類型來選定。對于 Acclaim Mixed-Mode WAX-1，和 Acclaim Surfactant Plus 具有弱陰離子交換（WAX）功能的色譜柱在乙腈-10 mM 乙酸銨（pH=5.0）充分過渡后，推薦用 100% 乙腈作為長期儲存溶劑。Acclaim Mixed-Mode HILIC-1可使用純水作為水相。

緩沖鹽pH：Acclaim系列混合模式色譜柱耐受pH范圍通常為2.5-7.5，推薦使用的pH范圍為3.0-6.0，賽默飛實驗室通常會在pH=4.0/5.0/6.0三個值進行緩沖鹽pH篩選。混合模式下緩沖鹽pH較為溫和，pH=4.0偏酸性，在Acclaim Mixed-Mode WCX-1分析堿性化合物時，既可以讓目標物充分電離，同時不會抑制固定相的羧基官能團；pH=6.0偏堿性，在Acclaim Mixed-Mode WAX-1分析酸性化合物時，既可以讓目標物充分電離，同時不會抑制固定相上的叔胺官能團。當分析物質(zhì)中酸性/堿性化合物同時存在時，可嘗試pH=5.0的緩沖鹽以兼顧二者的保留。

在混合模式方法開發(fā)中，常見的洗脫程序有等度洗脫程序、有機相梯度洗脫程序和緩沖鹽梯度+有機相梯度洗脫程序，如圖1所示。在洗脫過程中調(diào)節(jié)有機相-緩沖鹽比例時，應(yīng)盡可能避免出現(xiàn)鹽析。

圖1在混合模式方法開發(fā)中，常見的洗脫程序

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檢測器兼容性

與反相C18色譜柱一樣，無論是單一鍵合的Bi-modal，還是納米聚合物硅膠雜化的Tri-modal，Acclaim系列混合模式色譜柱鍵合相穩(wěn)定，柱流失較低，與常見的濃度型檢測器（DAD/MWD/VWD/FLD）和質(zhì)量型檢測器（ELSD/CAD/MSD）具有高度的兼容性。化合物有較強紫外吸收時，可選擇紫外檢測器；化合物有熒光響應(yīng)時，可選擇熒光檢測器；化合物在紫外端吸收較弱或無特征吸收時，可選擇電噴霧檢測器。在使用電噴霧檢測器時，應(yīng)選擇揮發(fā)性緩沖鹽，如甲酸銨、乙酸銨；在使用紫外檢測器時，目標物檢測波長接近紫外端時，應(yīng)選擇截止波長較低的磷酸緩沖鹽。

Acclaim系列混合模式色譜柱與常見檢測器的兼容性，如表2 所示。

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選擇性 α 的優(yōu)化

在反相模式下，通過調(diào)節(jié)選擇性 α 來優(yōu)化分離和保留是最為有效的，而選擇性 α 主要受流動相和固定相的影響，因此，調(diào)節(jié)有機相比例和種類、調(diào)節(jié)流動相 pH（水相）和改變固定相類型是優(yōu)化反相分離和保留最常見的三種方法。

在混合模式下，有機相優(yōu)先推薦使用乙腈，并且緩沖鹽濃度對離子交換影響較大，因此，優(yōu)化混合模式分離和保留的方法有調(diào)節(jié)離子強度、調(diào)節(jié)流動相 pH（水相）、調(diào)節(jié)有機相比例和改變固定相類型，其中調(diào)節(jié)離子強度和調(diào)節(jié)有機相比例較為常用。

如圖2所示，在Acclaim Mixed-Mode WAX-1色譜柱上，通過調(diào)節(jié)選擇性 α 來優(yōu)化丁基苯和對羥基苯甲酸的分離和保留；如圖3所示，在相同色譜條件下，苯甲酸、萘和芐胺分別在Acclaim Mixed-Mode WCX-1和Acclaim Mixed-Mode WAX-1上表現(xiàn)出不同的選擇性。

圖2在Acclaim Mixed-Mode WAX-1色譜柱上，通過調(diào)節(jié)選擇性 α 來優(yōu)化丁基苯和對羥基苯甲酸的分離和保留（點擊查看大圖）

圖3在相同色譜條件下，苯甲酸、萘和芐胺分別在WCX-1和WAX-1上表現(xiàn)出不同的選擇性

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如圖4和圖5所示，在Acclaim Trinity P1色譜柱上，通過調(diào)節(jié)有機相比例和緩沖鹽濃度來優(yōu)化Na⁺、K⁺、Cl^-和Br^-離子的分離和保留。

圖4在Acclaim Trinity P1色譜柱上，通過調(diào)節(jié)有機相比例來優(yōu)化Na⁺、K⁺、Cl^-和Br^-離子的分離和保留（點擊查看大圖）

圖5在Acclaim Trinity P1色譜柱上，通過調(diào)節(jié)緩沖鹽濃度來優(yōu)化Na⁺、K⁺、Cl^-和Br^-離子的分離和保留（點擊查看大圖）

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方法開發(fā)案例分享

羧甲司坦分子結(jié)構(gòu)含兩個羧基和一個氨基，pKa=2.06±0.10(Predicted)，屬于酸性化合物，因此選擇Acclaim Mixed-Mode WAX-1色譜柱。羧甲司坦在近紫外端無特征吸收波長，考慮到其他雜質(zhì)的響應(yīng)，檢測波長選擇215nm，因此緩沖鹽須選擇截止波長較低的磷酸緩沖鹽。最終流動相選定為乙腈-25mM磷酸氫二銨（磷酸調(diào)節(jié)pH至6.0），并配合梯度洗脫，羧甲司坦與相關(guān)雜質(zhì)可有效分離，峰形良好，柱效優(yōu)異，分離譜圖及數(shù)據(jù)如圖6 所示。

圖6 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 應(yīng)用于羧甲司坦有關(guān)物質(zhì)的測定（點擊查看大圖）

托吡卡胺分子結(jié)構(gòu)含苯環(huán)、吡啶環(huán)、酰胺和羥基，經(jīng)查詢化合物 pKa=5.3 (Uncertain)，由于吡啶環(huán)是一個典型的堿性結(jié)構(gòu)，并且有關(guān)物質(zhì)中的工藝雜質(zhì)多為堿性化合物，因此選擇Acclaim Mixed-Mode WCX-1色譜柱。流動相緩沖鹽選擇50mM磷酸氫二銨（磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0），并采用乙腈-水-緩沖鹽等度洗脫，托吡卡胺保留時間在8min左右。對照溶液濃度2.0mg/mL，進樣量50μL，主峰托吡卡胺并未出現(xiàn)嚴重過載，表明Acclaim Mixed-Mode WCX-1具有較高的載樣量，相關(guān)雜質(zhì)均能有效分離，且靈敏度較好，分離譜圖及數(shù)據(jù)如圖7所示。

圖7 Acclaim Mixed-Mode WCX-1 應(yīng)用于托吡卡胺有關(guān)物質(zhì)的測定（點擊查看大圖）

在陰陽離子Na⁺、K⁺、Cl^-、Br^-、I^-和SO₄^2-的分析中，實驗室采用Acclaim Trinity P1色譜柱配合CAD檢測器，流動相緩沖鹽選擇揮發(fā)性的乙酸銨，由于二價硫酸根洗脫需要高濃度的緩沖鹽，參考早期實驗方案的譜圖及數(shù)據(jù)，乙酸銨濃度選定為200mM，用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.0。流動相選擇乙腈-水-緩沖鹽梯度洗脫，Na⁺ 和K⁺，Cl^- 和Br^-，兩組離子分離度良好，分離度分別為2.17和1.71，SO₄^2-在洗脫程序后期90%高濃度緩沖鹽的洗脫下，峰寬較窄，峰形優(yōu)異，不對稱因子為1.28，分離譜圖及數(shù)據(jù)如圖8所示。

圖8 Acclaim Trinity P1 應(yīng)用于 Na⁺、K⁺、Cl^-、Br^-、I^-、SO₄^2- 的含量測定（點擊查看大圖）

如需更為詳盡的Acclaim系列混合模式色譜柱方法開發(fā)資料，可從賽默飛下載色譜柱產(chǎn)品說明及使用指南：

Product Specifications 產(chǎn)品說明

PS22091-EN ：Acclaim Mixed-Mode WAX-1 column: Total Control of Selectivity

PS22092-EN ：Acclaim Mixed-Mode WCX-1 column: For Separating Basic Molecules

PS22090-EN ：Acclaim Mixed-Mode HILIC-1 column: A powerful tool for separating polar molecules

PS22083-EN ：Acclaim Trinity P1 column: Superior pharmaceutical and counterion separations

PS20861-EN ：Acclaim Trinity P2 column: Ideal solution for pharmaceutical counterion analysis

PS20567-EN ：Acclaim Trinity Q1 column: For trace analysis of diquat and paraquat

PS20477-EN ：Acclaim Surfactant Plus column: Performance, versatility, throughput

Product Manual 使用指南

Acclaim Mixed-Mode WAX-1 Columns

Acclaim Mixed-Mode WCX-1 Columns

Acclaim Trinity P1 Product Manual

Acclaim Trinity P2 Product Manual

Acclaim Trinity Q1 Product Manual

Acclaim Surfactant Plus Product Manual

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● 賽默飛混合模式色譜柱方法開發(fā)指南 (Ⅰ)

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