2022/09 —— 賽默飛擴展您的科研視野
十年磨一劍，創新yong不停。值此金秋丹桂飄香之際，賽默飛重磅推出了三合一質譜系列的巨作——Thermo Scientific™ Orbitrap Ascend 三合一質譜系統。這是繼Orbitrap Eclipse 三合一質譜之后的再一力作，也是近10年來三合一質譜最大的革新。
Orbitrap Ascend質譜在提升整體性能和使用簡便性的同時，旨在解決生命科學研究中的挑戰，在蛋白質組學鑒定、定量蛋白質組學、結構生物學、生物制藥分析、以及小分子復雜性樣品研究等領域具有廣泛的應用潛力。本期小編將帶領大家來一段Orbitrap Ascend質譜應用之旅，以期借助我們的介紹，以小致大，讓賽默飛伴行您的科研之路，助力您拓展研究視野。
Orbitrap Ascend
全新升級
在質譜領域的漫漫長河里，新的技術嘗試層出不窮，各式各樣的質譜產品也曾豐富著這個市場。截至目前為止，在經典、耐用的質譜主要為四極桿、離子阱、基于傅里葉變換的FT和Orbitrap，以及飛行時間質譜，這幾類產品及其組合組成了目前市場上主要的質譜產品。2013年，基于四極桿、離子阱和Orbitrap質量分析器的三合一質譜橫空出世，集超高的分辨率、靈敏度、穩定性及各項擴展功能于一體，一經推出即獲得了廣泛的關注，極大地驅動了生命科學等領域的認知和應用。
△圖1：Orbitrap Ascend 三合一質譜儀
如今離第一款發布的三合一質譜Fusion的發布已近10年，最新型的三合一質譜儀Orbitrap Ascend質譜的革新成為了近10年來，內部結構變化最大的一次。
簡而言之，
Orbitrap Ascend主要的革新在于4個層面：
（1）采用更溫和的離子漏斗技術，減少易碎裂物質的源內裂解水平，提高檢測限，減少假陽性；
（2）C-Trap 前全新增加多級離子通道，用于常規離子儲存和MS2碎裂，提升靈敏度和掃描速度；后面的多級離子通道依然用于CID、 ETD, UVPD, PTCR and MSn HCD ，保持了系統的多功能性；
（3）采用全新傳輸模塊，提高高質量端離子傳輸效率，離子的掃描范圍擴大至m/z 16000（選配HMR?+模式）;
（4）全新的自動校正離子源，自定義校正的時間和周期，儀器自動進行校正，從而維持系統在最佳性能狀態；
形成了我們今天所看到的Orbitrap Ascend 三合一系統。
△圖2 Orbitrap Ascend三合一質譜內部結構示意圖
（點擊查看大圖）
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Orbitrap Ascend
應用領域的更新
Orbitrap Ascend 核心模塊的革新，帶來的是功能上的升級，以應對蛋白質組學對靈敏度和通量、生物制藥、結構生物學及小分子應用中不斷出現的挑戰，從而擴展研究的深度和范圍。
△圖3 Orbitrap Ascend三合一質譜應對
生命科學研究中的挑戰（點擊查看大圖）
2.1 常規蛋白質組學鑒定
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蛋白質組學一直是后基因組學時代重要的研究領域之一，如何提高蛋白質的覆蓋度，提升鑒定深度和廣度，一直是科學家們研究的方向之一。Orbitrap Ascend 質譜采用前置的IRM 提高了離子傳輸效率，靈敏度和掃描速度。
我們采用1 ug HeLa, 50 cm 色譜柱上樣，30分鐘和45分鐘分別可以鑒定到6137和6621個蛋白；46992和56175條肽段。蛋白和肽段的鑒定數量在相同時間下增加了15%和34%。有效的提升了分析的通量，降低實驗成本。
△圖4 Orbitrap Ascend有效提升蛋白和肽段
鑒定數目（點擊查看大圖）
2.2 翻譯后修飾
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然而，細胞的許多生命過程不僅與蛋白質的相對豐度相關，還受時空分布可逆的翻譯后修飾控制。因翻譯后修飾的蛋白的豐度往往較低，且并非很穩定，因此對儀器的性能提出了更高的要求。
Wisconsin-Madison學校的Josh Coon 實驗室針對蛋白質磷酸化的研究顯示，Orbitrap Ascend 質譜可檢測到12050條磷酸化肽段，8821個磷酸化位點。相比于前一代的產品，有18~25% 的提升。Coon 博士也對Ascend 系統的性能有著很高的評價，通過擴大磷酸化肽段的覆蓋度，提升信號通路深度挖掘或藥物活性細胞機制的檢測能力。
△圖5 Orbitrap Ascend有效提升PTM 磷酸化肽段
和位點數目（點擊查看大圖）
2.3 定量蛋白質組學—TMT定量
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TMT標記定量采用混樣一次上機多個樣本進行分析，可以大大的提升分析的通量。目前已推出了TMTpr 18-plex，一次性可以分析18個樣品。相對于常規LFQ 定量來說，TMT定量不單提高了分析的通量，同時具有更少的缺失值，數據記錄更為完整。
哈佛大學醫學院的Steven Gygi 團隊采用4個細胞系，12個高pH餾分分級，結合SPS MS³及實時搜索功能，定量了83386條肽段， 8788的蛋白。Gygi 博士表示，500個蛋白鑒定數量的差異，對于65分鐘梯度來說非常顯著，提升了定量蛋白研究的深度。
依賴于Ascend 系統更快的掃描速度及靈敏度，以及實時檢索，可顯著提高低上樣量樣品肽段和蛋白的鑒定數量（酵母酶解肽段，圖7），并進一步提高SPS-MS³的定量準確性。
△圖7 Orbitrap Ascend顯著提高TMT定量肽段
數目和通量（點擊查看大圖）
2.4 結構生物學及生物藥分析
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Ascend 質譜采用了新型離子傳輸模塊，有效的提高高質量端離子傳輸效率，離子的質量范圍擴展至m/z 16000（選配的HMR?+模式）。在蛋白高級結構解析及蛋白質與小分子共價結合分析領域中，更高的質量范圍可以有效提高蛋白質的檢測范圍。
采用選配的HMR?+結合多種碎裂方式，針對細菌中分子量約800 kDa的伴侶蛋白家族的蛋白質GroEL進行分析，在m/z 12,000左右可以清晰的表征。
△圖8 細菌中伴侶蛋白家族的蛋白質
GroEL分析（點擊查看大圖）
在完整蛋白分析中，提升檢測的質量范圍只能解決一部分問題。如何降低譜圖的復雜性，提供更多可供解析的譜圖是另一個核心點。當蛋白分子越大，帶電荷數就越復雜，很難解析出明確的帶電荷數目。另外，由于共流出的存在，往往存在譜圖非常復雜，造成可供解析的譜圖較少。
選配的質子轉移電荷減少技術（PTCR）通過將蛋白質帶有的質子轉移給全氟 (十四氫菲)離子，從而造成蛋白質本身電荷逐漸減少，形成一系列電荷減少的離子，再通過相鄰價態離子間的質荷比間距即可計算出蛋白質的電荷數目。在對細胞因子-Fc 融合蛋白進行分析時，采用PTCR技術與HMR?+ 的組合，簡化的譜圖將有助于去卷積。在m/z 5900~6050 這2個PTCR譜圖中，可以鑒定10 種完整糖型，從而從復雜混合物中解析到更多的蛋白質。
△圖9 PTCR技術去唾液酸化的Cytokine-FC
蛋白分析（點擊查看大圖）
2.5 全自動校正離子源
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在大隊列分析中，需要保持儀器一直處于最佳狀態，Ascend 系統在易用性上也做了極大的改進。可以更智能化的、自動化的來對儀器進行校正。我們只需要設定個校正周期，選擇好時間；軟件會自動開始運行校正的項目。從而節省出時間，并且一直維持儀器在一個良好的狀態。一般推薦每周校正一次即可。
質譜技術極大地驅動了生命科學、制藥以及食品環境領域的長足進步。這次發布的Ascend 系統，無論是在常規蛋白質組學；定量蛋白質組學；PTM 分析；完整蛋白質表征、生物制藥分析；還是偏向于小分子的代謝組學、脂質組學、代謝流等領域；Orbitrap Ascend質譜都可以提供強大靈活的功能相匹配，提升科學家們研究的深度和廣度。
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