奧利給/還看賽默飛
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隨著新冠類核酸疫苗的成功,核酸制藥行業開始蓬勃發展(如mRNA和小核酸)。在今年的ASMS中,應廣大客戶要求,賽默飛推出mRNA和小核酸的深度解析workflow,提供一站式解決方案(圖1)。該workflow涵蓋前處理、色譜分離、質譜表征、數據處理和報告輸出等內容,不僅幫助客戶全面、深度地解析核酸產品、指導工藝優化,還為核酸產品從研發到生產的轉換提供解決方案。
△圖1. 核酸深度解析workflow
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整體特點與優勢
★樣品前處理——完整的核酸酶體系:
包含H酶和T1酶等。其中,磁珠結合的T1酶,實現了核酸mapping分析的高覆蓋度和良好重復性;
★色譜分離——DNApac™ RP色譜柱:
為核酸的加帽、加尾和mapping分析提供良好的峰形和重復性;
★色譜分離——Vanquish™系列UHPLC:
生物兼容系統,極大減少金屬加合峰,提高目標組分的質譜響應;
★數據采集——Orbitrap系列質譜檢測器:
質量軸zui穩定、靈敏度和分辨率最高的Orbitrap質譜,用zui全面、清晰、可靠的數據為您呈現核酸產品本來的樣子;
★數據分析——BioPharma Finder軟件(以下簡稱BPF軟件):
精確到堿基的序列和修飾設置、靈活的酶切位置選擇、完善的加合峰設置,讓每一種可能盡在掌握。BPF 5.1升級去卷積方法,wan美實現硫代核酸的分子量解析。在核酸mapping分析中,BPF 5.1利用先*的動力學模型算法和隨機序列生成器,為核酸序列鑒定結果提供多重卡值,確保鑒定結果的可靠性。
mRNA的
mapping分析
Mapping分析時為了獲得特異性較強的長核酸片段,通常采用人為漏切的方法,但該操作也為Mapping分析帶來諸多挑戰(圖2)。
△圖2. Mapping分析的挑戰與賽默飛解決方案
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賽默飛核酸分析workflow(圖3)wan美解決mapping分析遇到的難題,實現核酸單個堿基鑒定和序列高度覆蓋分析(圖4),相關成果已發表在《Analytical Chemistry》(Vanhinsbergh et al, Analytical Chemistry, 2022, 94, 20, 7339–7349 )。
△圖3. BPF軟件mapping解析界面(上)和賽默飛mapping分析workflow(下)
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△圖4. 長達48 mer的核酸序列多價態(17、19、20)均可實現鑒定
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為了實現核酸序列的準確鑒定,除了優*的一級和二級數據以外,軟件的解析也bi不可少。BPF5.1采用先*的動力學模型算法,預測二級碎片m/z的同時還預測二級碎片的強度,綜合同位素峰形、二級碎片強度和質量偏差等因素得到的confidence卡值可減少核酸鑒定的假陽性(圖5)。此外,BPF5.1還創新性地將隨機序列生成器用于核酸序列鑒定卡值,進一步確保核酸鑒定的可靠性。
△圖5. 傳統的核酸二級預測圖(上)、BPF核酸二級預測圖(中)、核酸二級實測圖(下)
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mRNA 加 帽
Orbitrap的高靈敏度、高分辨率和高穩定性,以及BPF軟件靈活的序列設置,為全面解析加帽產品、準確計算加帽率保駕護航(圖6)。
△圖6. mRNA加帽檢測關鍵點
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mRNA加尾檢測
Orbitrap的高分辨率為polyA的檢測提供準確分子量,即使是分子量超過4萬的polyA偏差仍小于1 Da。同時,Orbitrap的高靈敏度可實現低豐度polyA組分的檢測,還原一個真實的polyA分布圖(圖7)。
△圖7. mRNA加尾檢測
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小核酸檢測
小核酸的檢測通常包含分子量、序列(同mRNA mapping的鑒定需求)、雜質(同mRNA mapping的鑒定需求)、臨床分析和代謝分析。其中,普通去卷積方法無法為一些修飾的小核酸,如硫代小核酸獲得準確的分子量。BPF5.1 軟件利用硫同位素的du特豐度分布,生成序列特異性的同位素模型,從而更為便捷地獲取精確解卷積結果(圖8)。
△圖8. 普通去卷積與含硫元素特異性去卷積用于硫代核酸分子量分析
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同時,Orbitrap的PRM模式,為小核酸的定量分析提供高選擇性、高靈敏度和高可靠性的結果(圖9)。
△圖9. Orbitrap系列質譜的PRM功能及其在血液中小核酸定量分析的應用
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BioPharma Finder軟件的靈活性與Orbitrap的高性能,為您繪制一張真實的小核酸代謝譜(圖10)。
△圖10. 小核酸修飾呈現(左)和代謝產物解析
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核酸藥物作為一類新型藥物,具有廣闊的前景,對其質量控制的法規要求也會愈加嚴格。Orbitrap高分辨質譜的高分辨、高靈敏度及高質量二級譜圖等優異性能,能夠更高效及深入地分析核酸結構、修飾變異體及相關雜質,可用于工藝優化及質量評估,提高其安全性及有效性。
創新的腳步不會停止,一起解鎖高階模式,未來可期。
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