超高分辨率讓“不可能”變為“可能”!

史曉磊

Isotope Abundance

同位素豐度，是指自然界中存在的某一元素的各種同位素的相對含量（以原子百分計）。如1H的同位素豐度為99.985%，2H為0.015%。可用于追蹤物質的運行和變化規律，借助同位素原子以研究有機反應歷程的方法，稱之為同位素示蹤法。因其所引用的同位素標記化合物的化學量是極微量的，不會對體內生理過程產生影響，獲得的分析結果符合生理條件，在代謝組學研究中被廣泛應用。

想在不受13C干擾的條件下去測量低豐度的2H示蹤以用于代謝研究，是幾乎不可能的，由于來自四極桿質譜的M+1質量同位素13C豐度很高，約為 18%，嚴重干擾了測定2H的標記示蹤[1]。但實際上，2H(0.015%)的低自然豐度使得示蹤劑劑量在理論上小于0.5%是可能的[2]，這需要*分辨率的質譜才能實現*的基線分離，而Orbitrap Exploris GC 240出現之后，憑借其240000的超高分辨率，讓以往在代謝研究中不可能實現的難題變為可能。

今天為大家分享一篇美國德克薩斯大學西南醫學中心的研究人員利用Orbitrap Exploris GC 240分析棕櫚酸中的2H同位素示蹤劑的應用。

圖1.棕櫚酸酯C16H31O2的質量同位素分布

摘要

新生脂肪生成(De novo lipogenesis, DNL)是由碳水化合物等非脂質營養物質合成的脂肪酸，是長期儲存熱量和維持細胞膜的主要營養物質[3]。監測DNL在細胞器、細胞、組織活檢、小鼠模型和人類等環境中的功能，將有助于發現新的分子生理學和許多不同疾病的潛在干預措施。DNL通量通常通過氘水(2H2O)給藥后2H摻入脂肪酸來測量。本文利用GC-Orbitrap解析2H和13C脂肪酸質同位素，允許DNL定量使用較低的2H2O劑量和較短的實驗周期。

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Orbitrap Exploris™ GC 240

科研利器，引領潮流

圖2. 穩定同位素2H2O是測定DNL的基礎

圖3.EI模式下的棕櫚酸甲酯的質譜圖

圖4.NCI模式下的棕櫚酸五氟苯酯質譜圖

通過比較棕櫚酸甲酯在EI模式和五氟溴代苯衍生棕櫚酸酯在NCI模式下的質譜圖，NCI測定五氟苯酯產生了未破碎的棕櫚酸鹽離子(C16H31O2，精確分子量為255.2324)，比EI檢測甲酯的效率和靈敏度高1000倍(見圖3和圖4)。

圖5. 采用不同條件驗證2H在棕櫚酸中的示蹤標記

針對不同AGC（自動增益控制）目標的靶向選擇離子監測(Target-SIM)(2*104, 2*105和3*106)，2H1和13C1的M + 1兩種方法都能很好地分辨。而但全掃描數據為易受離子損失，特別是在AGC目標值高的情況下，容易產生空間電荷效應。同時，準確度高(94-107%)，精度高(變異系數<10%)[5-6]，Target-SIM在定量時是更為合適的采集模式。

圖6.模擬人體水富集到0.3% 2H2O時棕櫚酸質量富集作為DNL的函數研究

棕櫚酸酯13C1和2H1 (M + 1)質量位移需要用165,000的最小分辨率進行分辨，以往用傅立葉變換離子回旋共振質譜法（FT-ICR-MS）可以實現，但掃描時間長，并需要超導磁體[7]，不易實現。當GC-Orbitrap商業化之后，成為很多代謝組學實驗室進行分辨13C和2H的優選。

為了確定這種方法是否比單位分辨率的質譜更有優勢，模擬了超高分辨率的質譜0-10%的DNL分數范圍和0.3%的體內水富集。結果證明，GC-Orbitrap為檢測極低前體和產物富集的DNL提供了主要的理論優勢。

圖7. 在其他脂肪酸中也可以檢測到2H富集

結論

本文介紹了一種HR-Orbitrap-GC-MS方法，該方法解決了其他同位素的2H質譜富集，來研究DNL生成。在棕櫚酸中直接檢測2H質量同位素可防止在低富集時與13C自然豐度的卷積，實驗證明，DNL可以在1小時內檢測完成，且2H2O的劑量比以前更低[8]。Orbitrap Exploris GC 240因其超高的24萬分辨率解決了代謝組學研究中一直以來的難題，成為代謝組學研究中*的利器。

參考文獻：

1. Brunengraber, H., Kelleher, J. K. & Des Rosiers, C. Applications of mass isotopomer analysis to nutritional research. Annu. Rev. Nutr. 17, 559 (1997). 

2. Diraison, F., Pachiaudi, C. & Beylot, M. In vivo measurement of plasma cholesterol and fatty acid synthesis with deuterated water: 

3. Wallace, M. & Metallo, C. M. Tracing insights into de novo lipogenesis in liver and adipose tissues. Semin Cell Dev Biol, https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2020.02.012 (2020). 

4. Murphy, E. J. Stable isotope methods for the in vivo measurement of lipogenesis and triglyceride metabolism. J. Anim. Sci. 84, E94–E104 (2006). 

5. Su, X., Lu, W. & Rabinowitz, J. D. Metabolite spectral accuracy on orbitraps.Anal. Chem. 89, 5940–5948 (2017). 

6. Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F. & Brunengraber, H.Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. J. Mass Spectrom. 31, 255–262 (1996). determination of the average number of deuterium atoms incorporated. Metabolism 45,817–821 (1996). 

7. Herath, K. B. et al. Determination of low levels of 2H-labeling using highresolution mass spectrometry: application in studies of lipid flux and beyond.Rapid Commun. Mass Spectrom. 28, 239–244 (2014). 

8. Previs, S. F. et al. Using [(2)H]water to quantify the contribution of de novo palmitate synthesis in plasma: enabling back-to-back studies. Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 315, E63–E71 (2018).