高分辨氫氘交換質譜技術解析天然免疫受體構象變化與信號傳導機制

MDA5是細胞內的異體RNA監測蛋白，屬于RIG-I樣受體家族（RLRs）的重要成員。MDA5參與多種RNA病毒引起的免疫反應，是天然免疫的一道重要屏障。RLRs家族共有RIG-I、MDA5及LGP2三個成員，其中RIG-I和MDA5的N端均擁有串聯CARDs結構域，可通過CARD-CARD同型相互作用招募MAVS，最終促進I型干擾素（IFN）通路的激活。在RLRs抗病毒信號的激活過程中，K63連接的多聚泛素鏈（K63-polyUb）起著關鍵作用[1]。前期研究發現，短鏈K63-polyUb可以通過共價錨定和非共價錨定兩種方式有效地促使RIG-ICARDs的寡聚[2, 3]。形成的異源四聚體復合物（K63-polyUb-RIG-ICARDs）可激活MAVSCARD寡聚，形成MAVS纖維的核心[2, 3]。然而，K63-polyUb是如何調控MDA5 CARDs組裝以及招募、激活MAVS CARD的分子機制，仍是待解決的科學問題。

Immunity

近期中國科學院上海藥物研究所鄭杰團隊在Immunity雜志上以Research Article形式在線發表了題為“Ordered assembly of the cytosolic RNA-sensing MDA5-MAVS signaling complex via binding to unanchored K63-linked poly-ubiquitin chains"的研究成果，本研究通過生物大分子氫氘交換質譜技術（HDX-MS）以及冷凍電鏡技術（Cryo-EM）揭示了長鏈，非錨定K63-polyUb促進MDA5-MAVS組裝程序與信號傳遞的分子機制。

MDA5-MAVS

首先

研究人員建立了K63-，K48-連接泛素鏈的生化合成平臺，并制備了不同長度的K63-polyUbn（2≤n≤14）（圖1）。通過基于Orbitrap Fusion平臺的氫氘交換質譜技術（Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry，HDX-MS），研究人員發現MDA5CARDs和RIG-ICARDs的氫氘交換保護程度依賴于不同長度的K63-polyUbn（MDA5: n≥8; RIG-I: n≥3）而不依賴于K48-polyUbn（n≥10）；并且保護強度隨著K63-polyUb的長度增加而特異性加強。

圖1：HDX-MS分析K63-polyUb（2≤n≤14）對RLR CARDs寡聚的影響（點擊查看大圖）

為了研究K63-polyUbn介導的MDA5CARDs寡聚體的組裝機制，研究人員利用冷凍電鏡首次解析得到了分辨率為3.3?的MDA5CARDs與K63-polyUb13復合體的結構。這也是MDA5CARDs第一個近原子分辨率的冷凍電鏡結構。

那么MDA5CARDs-K63-polyUbn異源四聚體又是如何招募其下游信號蛋白MAVS？

研究人員進一步通過Cryo-EM解析得到了分辨率為3.2?的由長鏈K63-polyUb11拴系的“自下而上"的左手螺旋MDA5CARDs-MAVSCARD復合體結構。

同時

研究人員通過生物大分子氫氘交換質譜技術，首次證明了人類MDA5全長蛋白的CARDs在初始狀態下處于張開的構象并可與長鏈K63-polyUb10結合。然而在早期研究中，氫氘交換質譜已經證明了RIG-ICARDs在初始狀態下呈閉合的構象[4, 5]。這也直接證明了RIG-I和MDA5的CARDs在溶液狀態下構象上的巨大差異。其次，研究人員進一步發現K63-polyUb10拴系的MDA5CARDs復合物在溶液中的穩定性受MDA5的RNA依賴的ATP酶活性別構調節。

圖2：HDX-MS分析全長MDA5在其識別配體或底物作用下（dsRNA/ATP/K63-polyUb）的動態的構象變化與信號傳導機制（點擊查看大圖）

綜上所述

該研究通過生物大分子氫氘交換質譜和冷凍電鏡技術發現長鏈，非錨定K63-polyUb類似于一個“分子橋梁"，促進了MDA5CARDs四聚體的組裝，使之形成一個激動狀態的構象來招募下游MAVSCARD，以進一步促進MAVSCARD的寡聚和激活（圖2）。激活狀態下的MDA5可以結合并水解ATP，遠程提升CARDs-K63-polyUb10的穩定性以持續激活MAVS。該研究彌補了MDA5通路激活與信號傳導研究的空白，進一步揭示了長鏈，非錨定K63-polyUb在細胞內作為內源性激動劑的免疫學功能，為理解泛素分子多樣性在抗RNA病毒天然免疫信號傳導與調控中的作用提供了新的線索。

* 上海藥物所博士后宋斌和美國NIH Research Associate陳運為論文第一作者，上海藥物所鄭杰研究員為論文的通訊作者。該工作得到了新加坡南洋理工大學羅大海教授、吳彬教授，美國Scripps研究所Patrick Griffin教授，上海藥物所羅成研究員和張乃霞研究員的大力支持，得到了國家自然科學基金、上海市浦江人才計劃等項目的支持。

專家訪談

鄭杰（中國科學院上海藥物研究所 研究員）

Q

根據您的經驗對氫氘交換質譜技術的理解？以及這篇文章的主要的難點在哪里？

答：我覺得HDX-MS是基于生物化學這個學科，圍繞表征酶活反應機理的一個很實用的技術，HDX-MS第一個應用是來自美國工業界，可以很好地應用于藥物發現。這個新工作的一個難點就是采用生化合成了不同長度的K63多聚泛素鏈，并對RLR CARDs進行了后續功能篩選和表征。如果無法系統合成K63-polyubn（n＞8），我們也無法解決這個科學問題。

Q

基于高分辨質譜技術的HDX-MS技術作為捕捉蛋白質溶液構象變化的重要研究工具，相對于冷凍電鏡技術提供哪些*的生物學信息？

答：HDX-MS和cryoEM提供的信息非常互補，首先，兩者聯用可以提供高分辨的結構和溶液中動態構象變化的信息。其次，在我們這個研究中，我們使用了HDX-MS去表征MDA5全長蛋白的一系列的構象變化，這對cryoEM研究是很有難度的，因為全長MDA5 的CARDs和Helicase之間的linker長度達到了120個氨基酸且在溶液中是非常活躍的，我們這次利用了HDX分析了MDA5與RNA，ATP互作如何遠程調控CARDs與K63-polyub的構象變化。表征好這一系列的構象變化就是表征MDA5在溶液狀態下是如果進行信號傳導的機制。

Q

HDX-MS技術目前有哪些應用方向，未來應用前景如何？

答：HDX-MS捕捉的是溶液狀態下蛋白質穩態的信息，研究蛋白質動力學，這對藥物發現（drug discovery）研究非常關鍵，可以大大加速藥物的發現與研發。HDX-MS可以直接提供藥物與小分子互作，以及生物大分子抗體藥物識別抗原等研究提供接近生理意義的重要信息。我博士后是在美國Scripps研究所Patrick Griffin教授進行的訓練，當時實驗室的同事很多都去了美國大藥企利用HDX-MS參與藥物發現。其中Mike還在禮來公司搭建了一套高通量全自動的HDX設備，專門為禮來的小分子藥物發現篩選而設定。回國后我們也正朝著這個方向努力，實現HDX-MS軟件和硬件的進一步自動化，希望未來在國內可以實現HDX-MS高通量。

另一個努力的方向是早日實現單氨基酸殘基分辨率的HDX-MS技術的升級，這可以 幫助精準表征藥物作用關鍵氨基酸殘基。為了實現這個目標，HDX-MS的自動化進樣平臺機械臂模塊需要一定的改造，比如更嚴格的控溫，更高頻率的連續進樣來優化質譜的采集效率。

最終我希望可以利用高通量HDX-MS平臺去建一個蛋白庫，提供氫鍵，自由能，單氨基酸殘基HDX等可以量化的參數，更精準的幫助科研工作者了解蛋白質的折疊，去折疊等穩態的信息。

關于作者

中國科學院上海藥物研究所鄭杰實驗室長期結合生物大分子氫氘交換質譜技術交叉解決由蛋白質（酶）的動力學異常變化所導致的重大疾病的發生機制，聚焦RNA天然免疫模式識別受體的內源，外源性配體識別與信號傳導機制，以及自身免疫疾病發生機制。圍繞氫氘交換及其應用，以第一作者或通訊作者在Immunity 2021，Anal Chem 2019，Nat Commun 2018，structure 2018， Nat Commun 2017，Nucleic Acids Res 2015等期刊上。

感謝鄭杰老師對本文的指導與支持

參考文獻：

1. Hu, H. and S.C. Sun, Ubiquitin signaling in immune responses. Cell Res, 2016. 26(4): p. 457-83.

2. Zeng, W., et al., Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell, 2010. 141(2): p. 315-30.

3. Peisley, A., et al., Structural basis for ubiquitin-mediated antiviral signal activation by RIG-I. Nature, 2014. 509(7498): p. 110-4.

4. Zheng, J., et al., High-resolution HDX-MS reveals distinct mechanisms of RNA recognition and activation by RIG-I and MDA5. Nucleic Acids Res, 2015. 43(2): p. 1216-30.

5. Zheng, J., et al., HDX-MS reveals dysregulated checkpoints that compromise discrimination against self RNA during RIG-I mediated autoimmunity. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 5366.