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Literature sharing
本次我們分享兩篇文章，分別于2022年09月和2022年10月發表于bioRxiv [1-2]，文章內容為在單細胞蛋白質組學領域，使用基于PD3.0_CHIMERYS檢索及質譜寬隔離窗口采集的方法，搭配全新的μPAC 色譜柱的賽默飛綜合解決方案，提升單細胞蛋白質鑒定的性能。接下來我們分別進行具體的介紹。
基于DDA采集模式與單細胞組學的低離子數目的特點，采用更大的隔離窗口，增加共隔離的離子數目，這是一種被認為是類似于結合了傳統的DDA與DIA的采集方法，文獻中將這個方法稱之為寬隔離窗口采集（wide window acquisition ,WWA)策略(如圖1所示)。
圖1：wide window acquisition (WWA)寬隔離窗口采集策略（點擊查看大圖）
PD軟件3.0版本自2022年年中發布以來，其對DDA蛋白質組學數據的性能提升有目共睹；如需CHIMERYS的介紹，可具體參考以下鏈接
《好風憑借力：CHIMERYS實現蛋白質組學數據的性能飛躍》
——賽默飛orbitrap組學俱樂部公眾號
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基于AI算法的CHIMERYS搜索引擎，可在一張二級譜圖中解析出多個PSMs，擅長于解析WWA采集得到的更加復雜的二級譜圖。
作為 LC-MS/MS的重要組成部分的低流速液相色譜，對減少樣品的復雜度、增加蛋白質組學的鑒定方面的貢獻尤為重要，通常我們可以通過拉長色譜梯度等方法來實現更好的分離，而這也會引入包括峰展寬在內的靈敏度的降低及檢測通量的降低等問題。而新發布的微柱蝕刻技術的μPAC系列色譜柱，具有高度有序的排列，有助于更加優異的峰寬表現且減小柱殘留，低背壓的設計也使其可以使用更大的流速，可以更快的上樣、清洗及平衡色譜柱，從而增加檢測通量(賽默飛提供的綜合解決方案如圖2所示)。
圖2：結合了低流速液相色譜、質譜及分析軟件的完整綜合解決方案（點擊查看大圖）
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不同的色譜柱性能比較
在色譜柱的比較中，與傳統的填充柱相比，作者對比了110cm的第二代μPAC色譜柱與其他兩款填充型色譜柱(50cm及25cm)，如圖3所示，上樣量為12.5ng Hela肽段，30min有效梯度，采用1Th的采集窗口，第二代μPAC色譜柱可以得到蛋白水平66%和肽段水平140%的提升。
而比較不同的μPAC色譜柱（5.5cm原型柱、50cm Neo柱和110cm二代柱），使用復雜樣品(HeLa, yeast, 和 E. coli按照8:1:1混樣)，10ng-400ng的上樣區間，蛋白鑒定結果如圖3所示。50cm的Neo色譜柱，在30min及60min梯度上具有優異的表現，特別是在低上樣量的條件下。我們需要的樣品的通量(梯度時間)及樣品的復雜度則決定了WWA方法對單細胞樣品的適用性，樣品通量是單細胞蛋白組學領域的重要關注點，使用5.5cm色譜柱搭配高流速，可實現到~100spd的水平。
圖3：不同的色譜柱性能比較
（點擊查看大圖）
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隔離窗口的優化
在WWA方法中，若使用了＞4m/z的較寬的母離子隔離窗口，使得臨近的母離子被共同碎裂，這時二級譜圖會形成類似于DIA采集方法的混合譜，這種方法不僅能增加鑒定數，還能提高鑒定時對低豐度肽段的靈敏度；對不同大小的隔離窗口進行優化，在250pg到400ng的上樣區間中，可以看到，更寬的隔離窗口更適合較小上樣量的結果，如250pg和1ng的上樣量下，隔離窗口12m/z和8m/z為最適效果。搭配于CHIMERYS的檢索方法，更大的隔離窗口所提供的譜圖復雜度，使得對低豐度肽段有更好的挖掘，拓寬了鑒定的豐度的動態范圍。
圖4：不同上樣量條件下隔離窗口的優化
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在質譜方法中，單細胞的樣品由于離子數更少，往往需要更高的最大離子注入時間，比如幾百個毫秒，這會導致二級譜圖數的降低，從而顯著的影響鑒定量。此時我們也可以配合使用更高的分辨率，可以識別更加復雜的離子，也就是說，我們可以使用更大的隔離窗口來提供更多的離子進行累積，并且通過高分辨率來識別這些離子，而后我們可以通過PD3.0 CHIMERYS引擎來對這些復雜的混合譜圖進行檢索。
使用經典的窄隔離窗口采集方法，與傳統的MS Amanda 2.0 引擎相比，CHIMERYS引擎可提升鑒定量2.6倍；而再加成上寬隔離窗口的WWA采集方法后，則可達到4.6倍的提升水平。
圖5：CHIMERYS搜索引擎提升蛋白質組學鑒定深度
（點擊查看大圖）
另一篇文獻中，作者使用0.2ng Hela肽段，對不同的隔離窗口、最大離子注入時間、分辨率等參數進行優化，發現在MS2分辨率為45k和60k時，我們能夠得到最多的PSMs鑒定數。在隔離窗口為8或者12Th時，會得到最好的結果。0.2ng Hela的上樣量，WWA模式可達到2,396個蛋白鑒定，比普通DDA模式鑒定量增加39%。
圖5：采用0.2ngHela肽段及40min對WWA模式質譜采集參數進行優化（點擊查看大圖）
在短梯度模式下，峰容量降低，使其譜圖的復雜度更高。基于CHIMERYS的破解高度復雜的混合譜的能力，使得更快的色譜分析成為可能。在使用12Th的隔離窗口與60k MS2分辨率的組合條件下，可得到最好的鑒定能力。使用此參數組合，更快的20min的鑒定量僅比40min少了10%（3160 vs 3524）。這說明，在并未顯著影響蛋白質組學鑒定量的條件下，WWA的采集方法適用于更快速的梯度分離。
由于WWA采集方法被認為是類似于結合了傳統的DDA與DIA的方式，故文章對不同的采集模式進行了比較；在單細胞水平的比較中（10個Hela細胞及7-10個K562細胞），使用相同的118ms和60K分辨率的二級參數，定性深度的比較中，WWA采集方法可得到最多的鑒定。
圖6：不同的采集模式（DIA, DDA 及 WWA）比較
（點擊查看大圖）
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結語
WWA采集方案的提出，為我們進行快速的、更高深度的單細胞蛋白質組學提供了新的思路：基于賽默飛綜合解決方案，我們從全新的Vanquish neo低流速液相色譜、μPAC色譜柱、寬隔離窗口的質譜采集策略以及全新的基于AI算法的CHIMERYS搜索引擎，全方面提升單細胞蛋白質組學鑒定深度。
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