腎功能障礙在最初階段的癥狀非常隱蔽，但后期可能導致腎功能不全、腎衰竭，甚至死亡。據估計，每年有300萬人患末期腎臟疾病，死亡數超過百萬。因此，早期實時監測腎功能不全對開展保護性干預和預防腎臟疾病的發展具有重要價值。

通過第二近紅外（NIR-II）熒光成像可以實現體內腎功能障礙的實時監測，對腎臟疾病的診斷和維護患者健康具有重要意義。然而，目前開發的腎臟可清除NIR-II熒光材料的光穩定性差、量子產率低、激發波長短（均位于NIR-I區域），導致相鄰生物組織中的背景信號高，腎臟成像的分辨率和信噪比低，限制了其在腎臟疾病研究中的應用。開發具有優異光物理性質的新型腎清除NIR-II發光材料十分具有挑戰性，但在該領域有巨大價值。

本研究合成了具有NIR-II激發和發射雙重功能的腎透明金納米團簇（gold nanoclusters, Au-NCs），具有深層組織穿透、高信號背景比和高量子產率等特點。這些優點使Au-NCs能夠實現高分辨率熒光成像，以及監測腎缺血再灌注（Renal Ischemia Reperfusion, RIR）和單側輸尿管梗阻（Unilateral Uretera Obstruction, UUO）引起的腎功能障礙（方案1）。本研究為NIR-II熒光成像提供了新的候選材料，并為腎臟疾病的高分辨率和精確成像提供了有力的工具。

方案1. 雙配體穩定的Au NCs的示意圖和NIR-II窗口中腎臟功能障礙的熒光成像監測。

在本研究中，通過兩步反應在水相中合成了一系列雙配體穩定的Au NCs。Au-配體復合物是通過將HAuCl4與MHA和另一種配體（包括Cystm、ME、DTT）混合，并在堿性條件下用NaBH4還原而形成的。透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，雙配體穩定的Au NCs是具有良好單分散性的超小球形顆粒（圖1a-d）。雙配體Au NCs與單配體MHA-Au NCs的吸收和發射光譜存在明顯差異，雙配體Au NCs在1000nm附近顯示出明顯的吸收峰（圖1e）；其NIR-II發光相較于單配體MHA-Au NCs增強了近16倍（圖1f-g）。使用NIR-II熒光染料IR-26作為參考，計算得MHA/Cystm-Au NCs、MHA/ME-Au NCs和MHA/DTT-Au NCs的QY分別為1.4%、2.0%和1.7%，明顯高于先前開發的腎可清除NIR-II熒光材料的值，說明Au-NCs作為腎透明熒光材料在生物成像應用中具有潛力。

圖1. NIR-II熒光圖像、TEM圖像和所制備的MHA-Au NCs（a）、MHA/Cystm-Au NCs（b）、MHA/ME-Au NCs（c）和MHA/DTT-Au NCs（d）的尺寸分布。（e）Au NCs的紫外-可見-近紅外吸收光譜。（f）Au NCs的熒光發射光譜。（g）Au NCs的發光強度的比較。

作者以MHA/Cystm-Au NCs為模型，在水中使用1% Intralipid模擬生物軟組織進行成像，進一步評估了它們的NIR-II熒光成像的穿透深度、分辨率和SBR。發現穿透深度隨著激發波長增加而增加（圖2a），1064nm激發下檢測到的熒光信號高于980和808 nm激發下的熒光信號，且熒光強度因材料厚度增加而降低的程度明顯更小（圖2b-c）。隨著激光和濾光片波長的增加，SBR不斷增加，毛細管半峰全寬逐漸減小（圖2d，e）。這些結果表明，采用長波長激發可以提高NIR-II成像的穿透深度、分辨率和SBR，也進一步證明了雙配體穩定的Au NCs用于生物成像的潛力。

圖2. （a）在不同激發（808、980和1064nm）下，用浸入1% Intralipid中的MHA/Cystm-Au NCs溶液填充的毛細管的熒光圖像。（b）來自（a）的沿著黃色箭頭的橫截面熒光強度分布。（c）MHA/Cystm-Au NCs在不同厚度（3、5和7mm）的Intralipid和不同激發激光下的熒光信號強度。（d）用不同的激發激光器和過濾器（2mm 1% Intralipid下）對填充有MHA/Cystm-Au NCs溶液的毛細管進行NIR-II熒光成像。（e）截面熒光強度分布圖（黑色）和沿（d）中黃線的高斯擬合線（紅色）。

接著作者進行了體內熒光成像研究，通過小鼠尾靜脈注射ICG、MHA-Au NCs和雙配體Au NCs，在1064nm的激發下于NIR-II窗口中成像，探究所合成的Au NCs在腎臟中的成像性能。如圖3a所示，注射MHA/Cystm-Au NCs后5分鐘，腎臟即被清晰區分，并且沒有觀察到來自鄰近組織的明顯干擾信號。隨著MHA/Cystm-Au NCs從腎臟中清除，腎臟區域的熒光強度逐漸降低，接著Au NCs通過輸尿管進入膀胱，在10分鐘時可觀察到膀胱區域的熒光信號，并在注射后3小時達到max值。隨后，Au NCs隨尿液排出體外。值得注意的是，MHA/Cystm-Au NCs的腎臟成像分辨率遠高于先前文獻中報道的分辨率，腎臟區域的SBR高達4.53（圖3b-c）。與MHA/Cystm Au NC相比，ICG和其他Au NCs對腎臟的成像能力相對較弱，SBR值相對較低。這證明了MHA/Cystm-Au NCs具有良好的腎臟成像能力。

圖3.（a）靜脈注射MHA/Cysm-Au NCs后24小時內KM小鼠的NIR-II熒光成像。（b）分別在靜脈注射MHA/Cysm-Au NCs、MHA/ME-Au NC、MHA/DTT-Au NCs、ICG和MHA-Au NCs后5分鐘KM小鼠的NIR-II熒光成像。（c）來自（b）的沿著黃線的橫截面熒光強度分布（黑色）和高斯擬合線（紅色）。

在上述研究的基礎上，作者使用MHA/Cystm-Au NCs分別對RIR和UUO誘導的腎功能障礙進行成像，以評估其實際應用能力。

RIR是腎臟疾病手術中的一種常見現象，容易導致急性腎損傷，并有發展為終末期腎臟疾病、帶來高死亡率的風險。作者通過手術夾閉小鼠腎動脈和靜脈建立RIR小鼠模型。將兩個實驗組小鼠的左腎分別夾緊30和60分鐘；假手術組在沒有夾腎的情況下進行了相同的手術，然后在術后15分鐘靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs，在注射后的不同時間點對小鼠進行成像（圖4a）。成像結果如圖4b所示。在假手術組小鼠中，左腎和右腎的熒光強度相當，并具有相同的衰減趨勢（圖4c-d）；對于缺血30分鐘的小鼠，左腎的熒光強度在5分鐘內增加到峰值，然后降低，下降的速度比假手術組慢，左腎和右腎的熒光強度比逐漸增加到1.3，這是由于缺血引起的左腎損傷，導致腎臟清除緩慢；對于缺血60分鐘的小鼠，左腎的熒光強度在注射后10分鐘達到max值，隨后降低，與缺血30分鐘相比，熒光強度下降的速度更慢，左腎與右腎的熒光強度比逐漸增加到2.2，表明缺血腎的清除率進一步減慢。這些結果表明，腎缺血時間越長，腎臟在注射Au NCs后達到m熒光的時間越長以及左腎和右腎的熒光之間的差異越大。隨著成像時間的增加，缺血性腎臟的SBR逐漸高于非缺血性腎臟（圖4e）。

圖4. （a）RIR小鼠模型的構建和RIR小鼠NIR-II熒光成像的時間線的示意圖。（b）靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs后RIR小鼠在不同時間點的NIR-II熒光成像。（c） 注射MHA/Cystm-Au NCs后缺血腎臟熒光強度的變化（*p＜0.05，**p＜0.01）。（d）RIR小鼠左腎和右腎的熒光強度比。（e）SBR用于靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs后不同時間點RIR小鼠缺血性腎臟的熒光成像。

UUO法常用于腎間質纖維化模型的制備。梗阻后，尿液潴留壓迫腎小管，導致腎小管上皮細胞進行性壞死，間質急慢性炎細胞浸潤，壞死的腎小管組織逐漸被纖維瘢痕取代，最終形成進行性腎間質纖維化。作者通過外科縫線完quan結扎小鼠左輸尿管建立UUO模型。結扎一段時間后，將MHA/Cystm-Au NCs靜脈注射到小鼠中，并在注射后的不同時間點進行NIR-II熒光成像（圖5a）。如圖5b所示，在注射后5分鐘檢測到腎臟中的NIR-II發光信號，并隨著時間的推移逐漸減弱。在接受輸尿管結扎0分鐘和30分鐘的小鼠中，左腎和右腎的信號之間沒有觀察到明顯的差異；在接受輸尿管結扎24小時的小鼠中，左腎的熒光顯著低于右腎（圖5c），且左腎的SBR低于右腎的SBR（圖5d）。表明輸尿管結扎24小時會導致腎濾過異常，結扎30分鐘則無顯著影響。

此外，作者還對兩組模型分別進行了H&E染色分析驗證腎損傷情況。結果顯示，使用UUO模型的實驗中，與假手術組的腎臟相比，UUO 24小時后，腎臟腎小管輕度擴張，腎小管上皮細胞少量壞死脫落，證實了UUO 24 小時誘導的輕微腎損傷。而在使用RIR誘導的腎損傷模型的實驗中，與未缺血的小鼠相比，缺血60min的小鼠的腎臟結構出現了一些明顯的損傷，表明60min的夾閉導致了嚴重的腎損傷。該結果與熒光成像結果一致，因為缺血60分鐘的小鼠觀察到蕞高熒光信號的時間晚于UUO 24小時的小鼠（圖4b, 5b）。這說明所制備的Au-NCs能夠區分不同的腎損傷情況，驗證了Au-NCs對腎功能障礙成像的能力。

圖5. （a）UUO小鼠模型的建立和NIR-II熒光成像的示意圖。（b）輸尿管結扎0分鐘、30分鐘和24小時的UUO小鼠靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs后的NIR-II熒光成像。（c）沿圖中黃線的橫截面熒光強度圖。（d）注射MHA/Cystm-Au NCs后5分鐘，不同結扎時間的UUO小鼠腎臟熒光成像的SBR。

總之，本研究成功合成了一系列具有NIR-II激發和發射的雙配體穩定的Au NCs，可用于體內RIR和UUO誘導的腎功能障礙的高分辨率熒光成像。與以往的腎功能NIR-II成像相比，在NIR-II激發下的熒光成像可以更清晰地顯示腎臟，實現對腎功能障礙的更準確診斷，為腎功能障礙的高分辨率精確成像提供了有力的工具。

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