本文要點：胰腺癌是 zui 具有侵襲性和致命性的惡性腫瘤之一，然而常規光療材料具有穿透深度較低、對氧的依賴性強、對熱休克蛋白抑制作用高的缺點，制約了整體治療效果。在這項研究中，作者設計了一種具有聚集誘導發射(AIE)特征的光敏劑DCTBT，該光敏劑具有近紅外二區熒光成像(NIR-II FLI)、I型光動力療法(type-I PDT)和光熱療法(PTT)的功能。在EGFR靶向多肽修飾的兩親性聚合物的輔助下，制備的DCTBT脂質體能夠有效地在胰腺腫瘤部位蓄積和可視化，并顯著抑制PANC-1皮下和原位腫瘤模型的腫瘤生長。

方案1. 分子設計示意圖及其在NIR-II-FLI引導的I型PDT-PTT協同胰腺癌治療中的應用

首先對分子進行設計，DCTBT是在CTBT的基礎上在咔唑中引入二苯胺片段。二苯胺片段可以促進分子內較強的D-A相互作用，實現較低的帶隙和吸收、發射波長的紅移。另外，較強的D-A相互作用可以進一步分離HOMO和LUMO之間的分布，獲得較小的單重態-三重態能隙，促進I型ROS的產生。此外，二苯胺片段可以作為自由旋轉的分子旋轉體，消耗激發態能量，顯著降低分子間的π-π相互作用，提高DCTBT的AIE表征。

圖1. A)CTBT和DCTBT在CHCl3中的歸一化吸收光譜 B)DCTBT在不同含水率(fw)的THF/水混合物中的熒光光譜 C)相對發射強度(I/I0)與含水率的關系圖，I0和I分別是這兩個分子在THF和THF/水混合物中的熒光強度峰值 D)CTBT和DCTBT的粒度分布 E)CTBT和DCTBT的透射電子顯微鏡圖像 F)CTBT（左側）和DCTBT（右側）在水溶液中的歸一化吸收光譜 G)兩種NPs在水溶液中的歸一化發射光譜 H)兩種NPs和ICG的光穩定性 I)兩種NPs和IR-26(QY=0.5% 在二氯乙烷中)在五種不同濃度下的積分熒光光譜(900-1500nm)的曲線圖

接著進一步探索CTBT和DCTBT在聚集態的熒光性質。如圖1B-1C所示，水含量從0%到90%，CTBT熒光強度都是低于溶液狀態的熒光強度。而水含量為90%的DCTBT的熒光強度比溶液狀態提高了5.9倍，表明DCBTB具有AIE特征。推測是由于DCBTB中二苯胺片段使DCBTB具有豐富的分子旋轉和較大的扭曲構型，抑制了有害的分子間相互作用。為了驗證這樣推測，估算這兩個NPs的扭曲分子內電荷轉移(TICT)性質，結果表明DCTBT具有高度的激發態和更強的TICT性質，驗證了上述推測。

為了在形態水平上進一步解釋CTBT和DCTBT的光物理性質，以兩親共聚物DSPE-PEG2000為包覆基質，將CTBT和DCTBT組裝成納米粒子。制備的NPs具有良好的水分散性，呈球形，直徑分別為67nm和100nm左右（圖1D-1E），具有良好的的光穩定性（圖1H），DCTBT NPs具有近紅外二區發射（1F-1G），以IR-26(QY=0.5%)為參照，CTBT NPs和DCTBT NPs水溶液的量子產率分別為16.92%和4.37%（圖1I）。這兩個NPs具有NIR-II發射特性和高熒光效率，是生物應用的理想候選者。

圖2. 在CTBT或DCTBT NPs存在下A)DCFH(整體ROS檢測)、B)DHR123(O2·-檢測)和C)HPF(·OH檢測)在不同時間激光照射下的熒光強度的相對變化D)在CTBT或DCTBT NPs存在下，ABDA(1O2檢測)在不同時間激光照射下的分解率E)相同摩爾濃度的CTBT和DCTBTNPs在808nm（0.8W cm-2）激光照射5min冷卻至室溫下的光熱曲線 F）DCTBTNPs在808nm（0.8W cm-2）激光照射6min的光熱性能與濃度的關系

接下來先用DCFH-DA來評價總的ROS產生（圖2A）,接著用不同探針檢測ROS的種類，先用DHR123和HPF來檢測是否通過I類路徑產生·OH和O2·-（圖2B-2C），接著用ABDA來檢測是否通過II類路徑產生的1O2（圖2D），這些結果表明兩個NPs都具有產生ROS的能力，但是II路徑產生的ROS被抑制，可以通過I路徑產生·OH和O2·- 。

進一步評價兩個NPs的光熱性能。如圖2E所示，CTBT NPs和DCTBT NPs水分散體的zui高溫度分別達到55.7℃和62.8℃，結合光熱轉換率，得到DCTBT NPs比CTBT NPs具有更優異的光熱轉化性能的結論，推斷可能是DCTBT中二苯胺使DCTBT的構象更加扭曲，導致更有效的非輻射衰減過程。DCTBT NPs表現出濃度依賴的溫度升高（圖2F），驗證了上述推測。

圖3. A)用DCFH、DHE、AFP和SOSG分別作為總ROS、O2·-、·OH和1O2熒光指示劑檢測PANC-1細胞中的ROS，比例尺：100μm B)不同濃度的lip-DCTBT NPs與PANC-1細胞孵育后，在無或者有激光（808nm，0.8W cm-2）照射下的細胞活力 C）經lip-DCTBT NPs處理后的PANC-1細胞的活/死細胞染色。綠色和紅色分別代表活細胞和死亡細胞，比例尺：200μm

接著以卵磷脂、膽固醇和DSPE-mPEG2000為包封劑，制備疏水性DCTBT脂質體（Non-Target-NPs），再用DSPE-PEG2000-GE11修飾脂質體表面制備具有癌細胞靶向性的NPs（Target-NPs）。lip-DCTBT NPs具有較高的水溶性，呈球形，平均粒徑為80nm（Cryo-TEM）和121nm（DLS）。Target-NPs和Non-Target-NPsZETA電位分別為-20.3mV和-24.3mV。

進一步研究lip-DCTBT NPs在PANC-1癌細胞中的細胞內ROS產生。如圖3A所示，有lip-DCTBTNPs加激光照射后，DCFH-DA、DHE和APF三種探針都呈現出明亮的綠色或紅色熒光，而對照組幾乎沒有觀察到明顯的熒光信號，值得注意的是，Target-NPs的熒光強度遠高于Non-Target-NPs，這表明lip-DCTBT NPs能有效地在PANC-1癌細胞中通過I類途徑產生O2·-和·OH，而且腫瘤靶向配體可以促進NPs在癌細胞中的轉運和積聚。

用CCK-8比色法評價對PANC-1癌細胞的體外協同光治療的效果。如圖3B所示，表明Target-NPs和Non-Target-NPs對PANC-1癌細胞的毒性作用具有劑量依賴性。接著用活/死細胞染色實驗進一步驗證這兩種NPs對PANC-1癌細胞的治療效果，如圖3C所示，表明，lip-DCTBT NPs對PANC-1癌細胞有毒性作用，其中Target-NPs光療效果比Non-Target-NPs好。兩個實驗結果一致，證明了Target-NPs對PANC-1癌細胞具有良好的光消融能力。

圖4. A)靜脈注射lip-DCTBTNPs后不同監測時間的PANC-1荷瘤小鼠皮下NIR-II熒光圖像，a：Non-Target-NPs，b：Target-NPs B)熱成像，注射lip-DCTBT NPs后8小時，荷瘤小鼠在連續808 nm激光照射下（腫瘤部位）的加熱溫度 C)各治療組的相對腫瘤體積變化，**P < 0.01, ***P <0.001 D)不同治療后第17天采集的腫瘤圖像，比例尺：1cmE)第17天記錄各組平均瘤重，**P<0.01 F)不同治療方法腫瘤組織的H&E、Ki67和TUNEL染色分析，比例尺：200μm

緊接基于良好的體外光療性能，作者對PANC-1腫瘤進行了體內評估。在體內對lip-DCTBT NPs進行NIR-II FLI，如圖4A所示，lip-DCTBT NPs在注射48h后腫瘤部位的熒光信號仍然很強，并且Target-NPs組比起Non-Target-NPs組在腫瘤部位呈現出更明亮的熒光成像，這表明lip-DCTBTNPs在腫瘤部位中具有長期NIR-II熒光示蹤的潛力，引入的EGFR配體使lip-DCTBT NPs的腫瘤靶向能力增強。

為了進一步驗證lip-DCTBT NPs的光熱治療潛力，在皮下PANC-1腫瘤小鼠上進行了體內光熱評估。如圖4B所示，Target-NPs處理的小鼠腫瘤區域的溫度在1min內從32.9℃迅速上升到59.6℃，在5分鐘內達到63℃左右的平臺值，并且表現出更高的溫度升高，這顯示出lip-DCTBT NPs在PTT應用的巨大潛力。

在皮下腫瘤模型上評價lip-DCTBT NPs的光療效果，將PANC-1荷瘤BALB/c裸鼠隨機分為5組（PBS；PBS+laser；Target-NPs；Non-Target-NPs+laser；Target-NPs+laser）。如圖4C所示，對照組(PBS；PBS+laser；Target-NPs)的腫瘤體積持續增大，相比之下，實驗組（Non-Target-NPs+laser；Target-NPs+laser）的腫瘤生長得到明顯抑制，并且Target-NPs+laser的抑瘤率（87.5%）明顯高于Non-Target-NPs+laser（72.7%）（圖4D-4E），實驗結果表明NPs加上激光照射才具有殺瘤效果，靶向性的NPs具有更好的殺瘤能力。為了進一步探討不同治療方法的抗腫瘤效果，采用組織學和免疫組織化學方法（包括H&E染色、Ki67檢測和TUNEL檢測），對腫瘤活檢組織進行分析。結果表明Target-NPs+laser處理的腫瘤組織比起其他組，顯示出嚴重的損傷和大量空泡化，表現出zui低的增殖和zui高的凋亡水平（圖4F）。

圖5. A)原位PANC-1腫瘤模型體內光療的時間表B)在治療過程中不同時間點記錄的不同組小鼠的生物發光圖像 C)在第16天記錄各組的平均瘤重，**P<0.01 D)治療后第16天切除脾的腫瘤圖像，比例尺：1cm E)不同治療方法腫瘤組織的H&E、Ki67和TUNEL染色分析，比例尺：200μm

最后研究lip-DCTBT NPs用于胰腺原位腫瘤模型的光療效果。將荷瘤小鼠隨機分為5組（PBS；PBS+laser；Target-NPs；Non-Target-NPs+laser；Target-NPs+laser）。如圖5B所示，對照組(PBS；PBS+laser；Target-NPs；)腫瘤的熒光信號逐漸增強，相反，實驗組（Non-Target-NPs+laser；Target-NPs+laser）的小鼠在腫瘤部位出現了較弱的熒光強度。五組依次的平均腫瘤解剖重量為0.54、0.57、0.53、0.16和0.04g（5C-5D），這些實驗結果表明lip-DCTBT NPs+laser才具有良好的腫瘤生長抑制作用，靶向性的NPs具有更好的殺瘤能力。之后用H&E染色、Ki67和TUNEL法檢測腫瘤細胞的增殖活性(圖5E)，驗證了上述的結論。

結論：作者成功開發了一種AIE活性的光熱敏劑，它同時具有NIR-II FLI、type-I PDT和PTT功能。通過在CTBT主鏈上合理地引入二苯胺片段，得到具有更好AIE性質和吸收、發射波長紅移的DCTBT分子。為了zui大限度地提高光療效果，進一步將EGFR靶向多肽修飾的兩親性聚合物DSPE-PEG2000-GE11作為包裹基質，來促進lip-DCTBT NPs在腫瘤部位的積累。體外和體內實驗表明，Target-NPs在NIR-II FLI引導的I型PDT-PTT協同治療下，對PANC-1皮下和原位腫瘤模型的腫瘤生長有明顯的抑制作用。這些研究發現為探索*的胰腺癌光療材料開辟新的視角，并刺激臨床試驗的 zui 新的發展。

參考文獻

D. Li et al."Synchronously boosting type-I photodynamic and photothermal efficacies via molecular manipulation for pancreatic cancer theranostics in the NIR-II window."Biomaterials.283 (2022) 121476.

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