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恒光講堂|用于開發激活近紅外二區熒光探針實現體內分析物傳感多功能平臺

時間:2022/3/16閱讀:481
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本文要點:基于小分子的第二近紅外 (NIR-II) 可激活熒光探針可以潛在地提供高目標背景比和深層組織穿透。然而,由于缺乏通用且穩定的光學可調基團,大多數報道的 NIR-II 可激活小分子探針的通用性較差。在這項研究中,作者設計了 NIRII-HD,一種針對 NIR-II 探針開發進行優化的新型染料支架。特別是,染料 NIRII-HD5 表現zui jia光學特性,如適當的 pKa 值、出色的穩定性和高 NIR-II亮度,這有利于高對比度的體內成像。為了證明 NIRII-HD5 染料的適用性,設計了三種用于 ROS、硫醇和酶的靶向激活 NIR-II探針。使用這些新型探針,不僅在小鼠模型中實現了不同疾病的可靠 NIR-II 成像,而且還以高保真度評估了體內肝損傷期間肝組織的氧化還原電位。


圖 1. a) 報告的已激活探針平臺 b) 新型活化探針平臺NIRII-HD染料的合理設計


圖 2. a) O-HD 和 NIRII-HD1 在 PBS 緩沖液中的歸一化吸收和發射光譜; b)50μM HClO 和 c) 5μM ONOO-的時間依賴性吸收光譜;d) 50μM HClO 和 e) 5μM ONOO- 的時間依賴性吸收光譜; f)NIRII-HD3 和g) NIRII-HD5 的歸一化吸光度與 λmax 處 pH 的對應圖;h) ICG/O-HD (5μM) 和 NIRII-HD 染料(1-5 分別代表 NIRII-HD1-5)在 PBS(pH 7.4,含有 30% EtOH 和 1% 吐溫)中的相對吸收 i) PBS 緩沖液中染料溶液的歸一化吸收



[a]φ(900–1200 nm)使用 IR26 作為參考(Φf = 0.05%,二氯乙烷); PBS 緩沖液:pH 7.4,含有 30% EtOH 和 1% tween-80



首先為了設計具有與 O-HD 相似性質的 HD 類 NIR-II 染料需要:(1)增強 O-HD 的吲哚雜環部分的供體強度以延長其發射, (2) 在 O-HD 的破壞位點引入封端基團以增加其穩定性;(3) 降低 O-HD 或其類似物酚基的 pKa 值以增強其相應分子探針的響應性能在生理環境中。基于這些考慮,合成了新型 HD-like NIR-II 染料 NIRII-HD1-5,并且評估了表zui jia染料NIRII-HD5 用于體內成像的潛力。MTT 測定并證明 NIRII-HD5 對細胞活力沒有顯著影響,然后,在體內評估 NIRII-HD5 的細胞毒性,實驗組小鼠未出現任何器官損傷。

圖 3. a) 淋巴結成像示意圖 b) O-HD及其類似物(標記為1、2和3)和NIRII-HD5(標記為4)的結構式 c) O-HD 及其類似物與 NIRII-HD5 在 NIR-I 或 NIR-II 熒光成像窗口對腘窩淋巴結的比較;使用 d) NIRII-HD5 和具有 (+)/不具有 (-) 激光照射和夾子阻斷的 ICG 在注射后的不同時間點拍攝的腘窩淋巴結的熒光圖像 e) 用 (+)/不用 (-) 激光照射的腘窩淋巴結的熒光強度信號與從圖 3d 獲得的時間作圖


其次,探索了 NIRII-HD5 在活體深部組織成像方面的能力,并將成像性能與 O-HD 的成像性能進行了比較。從活體成像中可以看到,混合溶液皮內注射后,NIRII-HD5在NIR-II窗口(1000-1700 nm)有清晰的淋巴結成像,其SBR高達10.5 (圖 3a-3c)。相比之下,O-HD 及其兩種類似物在發射通道(695-770nm,NIR-I 區域)中顯示出弱熒光以及較差的信背比(SBR < 2.4)(圖 3c)。這些結果表明,O-HDs在活體小鼠淋巴結中的不良成像性能主要是由于NIR-I光的組織穿透力較弱和組織背景自發熒光較強,進一步證明了NIRIIHD5*的深部組織成像能力。


如圖3d和3e所示,860 nm激光照射5分鐘后,NIRII-HD5仍能清晰區分淋巴結,NIRII-HD5的熒光強度保持不變。相比之下,ICG 在相同通量率下用 808 nm 激光激發 5 分鐘后大部分褪色,僅保留初始發射強度的 30%。結果表明 NIRII-HD5 具有優異的光穩定性,這將有利于長時間的體內成像。此外,值得注意的是,腘窩淋巴結的ICG信號在照射后5分鐘即可恢復,說明小鼠的淋巴管未受損,因此富集在小鼠足底的ICG染料可以流到小鼠足底。淋巴結再次通過淋巴管(圖3d-3e)。為了進一步證實這一點,增加了一個實驗,在激光照射后用止血夾阻塞淋巴管。結果顯示,與未使用止血夾的對照組相比,ICG淋巴結信號的恢復明顯受到抑制(圖3d-3e)。


圖 4. a) 分別用于 ONOO-、GSH 和 ALP 檢測的三個探針的設計 b) NIRII-HD5-ONOO-(5μM), e) NIRIIHD5-GSH (5μM), h) NIRII-HD5-ALP (5μM) 分別響應生物標志物的歸一化吸收光譜 c)NIRII-HD5-ONOO-(5μM)響應ONOO(0-10μM)的熒光光譜 d) NIRII-HD5-ONOO- (5μM) 對各種分析物的熒光響應 f)NIRII-HD5-GSH (5μM) 響應 GSH (50–1400μM) 的熒光光譜 g) NIRII-HD5-GSH (5μM) 對各種分析物的熒光響應


接著,如圖 4a 所示,基于 NIRII-HD5,開發了三種可激活的 NIR-II熒光探針 NIRII-HD5-GSH、NIRII-HD5-ONOO-和 NIRII-HD5ALP,用于檢測 GSH、ONOO-和 ALP 活性,選擇這三個成像目標是因為它們代表三種不同類型的分析物(ROS、硫醇和酶),同時在各種生物過程中也很重要。選擇性實驗表明,NIRII-HD5-ONOO-對ONOO-表現出比其他生物物種高的選擇性(圖4d),表明它可以用作ONOO-檢測的有效熒光探針。同樣,探針 NIRIIHD5-GSH 也可以在 PBS 緩沖液中被 GSH 有效激活。如圖 4e-4g 所示,在 1.4 mM GSH 存在下,NIRII-HD5-GSH 在 895 nm 的峰值處表現出顯著的熒光增強,而在添加其他生物物種后觀察到的變化可忽略不計。最后,確定 NIRII-HD5-ALP 保留了其對 ALP 的響應性。與探針 NIRII-HD5-ONOO- 和 NIRII-HD5GSH 類似,探針 NIRII-HD5-ALP 也顯示出 ALP 依賴性響應和優異的選擇性(圖 4h )。總的來說,結果表明,與原始染料 O-HD 相似,新型染料 NIRII-HD5 可用作設計用于 NIR-II 傳感的可激活熒光探針的有效平臺。


圖 5. a) 使用 NIRII-HD5-ONOO- 探針(1:腘窩淋巴結;2:坐骨淋巴結)對 LPS 誘導的淋巴炎癥進行示意圖和 NIR-II熒光成像 b)隨時間推移,從 LPS 處理/鹽水處理組獲得的腘(紅圈)和坐骨神經(藍圈)淋巴結的熒光信號 c) 轉移性腫瘤誘導的前哨淋巴結的體內成像 NIRII-HD5-GSH探針4T1淋巴結轉移模型建立及腫瘤側及正常側淋巴結熒光成像示意圖。d) 圖 5c 中隨時間從腫瘤側/正常側獲得的腘窩和坐骨淋巴結的熒光信號 e)正常側和腫瘤側淋巴結切片中CD206的免疫組織化學圖像


緊接著為了證明NIRII-HD5 衍生探針用于體內熒光檢測的能力,NIRII-HD5-ONOO- shou ci用于檢測脂多糖 (LPS) 皮內注射誘導的淋巴炎癥小鼠模型中的 ONOO-。如圖5a所示,與生理鹽水處理的對照組相比,LPS誘導的實驗組腘窩和坐骨淋巴結在NIRII-HD5-ONOO-給藥后均表現出明顯的亮度。特別是,與對照組相比,LPS 組中腘窩淋巴結的信號在注射探針后 30 分鐘后增加了2 倍(圖 5b)。該結果表明LPS確實可以誘導淋巴結炎癥,探針NIRII-HD5-ONOO-可用于對該過程進行成像。


為了進一步可視化和跟蹤淋巴實體瘤轉移,通過GSH特異性反應探針檢測到淋巴管中GSH的波動。因此如圖 5c 所示,當將 NIRII-HD5-GSH 注射到 4T1 荷瘤小鼠的左右后爪中時,在腘窩和坐骨淋巴結中觀察到了耀眼的 NIR-II 熒光。腫瘤側(右側),而小鼠正常側(左側)的淋巴結表現出弱熒光。相比之下,在正常小鼠(無荷瘤小鼠)兩側的淋巴結中檢測到幾乎相同的微弱熒光信號。量化平均強度顯示,腫瘤側腘窩和坐骨淋巴結區域的信號比正常側高出3倍,表明確實發生了癌細胞通過淋巴管的代謝遷移(圖5d)。這些結果證實,源自NIRII-HD5 的新型 NIR-II 探針可用作體內疾病診斷的有效工具。

圖 6. a) APAP 誘導的肝損傷和 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 治療的示意圖 b) 分別通過探針 NIRII-HD5-GSH 和探針 NIRIIHD5-ONOO- 用鹽水、APAP 和 APAP+NAC 處理的小鼠肝臟的 NIR-II 圖像, SBR 從圖 6b 中的 c) NIRII-HD5-GSH 和 d) NIRII-HD5-ONOO- 獲得 e) 用鹽水、APAP 和 APAP+NAC 處理的小鼠肝臟的代表性組織學


APAP 在肝臟中進行酶促生物轉化產生 N-乙酰基-對苯醌亞胺 (NAPQI),該亞胺可被谷胱甘肽 (GSH) 迅速還原。APAP過量后,過量產生的NAPQI會消耗GSH,導致細胞蛋白直接結合,導致線粒體功能受到干擾,釋放出大量ROS(如ONOO-),此外,N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 作為一種保肝藥物,可產生 GSH 來抵消 APAP 引起的肝臟氧化應激(圖 6a)。最后檢查了 NIRII-HD5 探針(NIRII-HD5-GSH 和 NIRII-HD5-ONOO-)是否可以監測這一過程體內具有 NIR-II 成像。如圖 6b 和 6c 所示,用鹽水處理的正常 Balb/c 小鼠在施用 NIRII-HD5-GSH 后在肝臟中顯示出高熒光。在用 300 mg kg-1 APAP 預處理 12 小時后,在小鼠肝臟中觀察到 NIR-II熒光顯著降低。相比之下,探針NIRII-HD5-ONOO- 在藥物刺激前后小鼠肝臟中表現出相反的熒光變化(圖 6b 和 6d)。這些結果表明,隨著藥物性肝毒性的發生,小鼠肝臟中的GSH被消耗,肝臟組織中的ROS(ONOO-)顯著增加。小鼠先用 300 mgkg-1 APAP 預處理誘導肝損傷,然后用 NAC (600 mg kg-1) 治療,與僅接受 APAP (300 mg kg-1) 的小鼠相比,NIRIIHD5-的熒光顯著增強觀察到 GSH 和 NIRII-HD5-ONOO- 明顯減少。


參考文獻

Angew Chem Int Ed Engl. 2022 Feb 25:e202201541. doi:10.1002/anie.202201541. Epub ahead of print. PMID: 35218130.



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