單細胞測序的難點在于如何把不同類型的組織解離成單細胞懸液。目前，主要的單細胞分離方法有口吸法、顯微操作法、流式細胞法、微流控。
顯微操作法是一種能夠直接觀察到單細胞分離的方法。這一方法能夠準確控制單個細胞的吸取與釋放，但是對實驗操作的要求較高，不利于規模化操作，FACS則能夠大規模獲得單細胞樣本，該方法是利用流式細胞儀，借助于細胞表面標記分選出特定群體的細胞或單個細胞。
雖然這一方法需要專門的設備，且細胞的消化和分選過程會對細胞狀態產生一定的影響，但是該方法的效率和準確率較高，標準統一，有利于不同實驗室實驗研究的比較，而流式和微流控的方法可以適用于大規模分離單細胞懸液，而大規模分離單細胞首先需要制備細胞活力較高的細胞懸液。
懸液制備和質控中的注意事項：
1、組織樣本制備懸液時間不超過4h；
2、單細胞分離懸液中不能含有Ca2+和Mg2+，且不能含有Tween80之類的表面活性劑，否則會影響細胞活性；
3、根據項目的情況選擇合適尺寸的細胞篩。細胞尺寸可選20~40μm不等，目的是濾掉雜質和細胞團；
4、解離好的細胞懸液武漢樣本庫技術服務平臺推薦細胞活率為85%以上，低于75%不能上機；
5、細胞懸液的適宜濃度700-1200cells/μL。濃度過高，上樣體積太小，誤差太大；濃度太低，體積太大，會帶入一些雜質和細胞團等；
6、細胞懸液制備完成后要盡快建庫，樣本制備好到上機的時間間隔不宜超30min。不能保證同時制備多個樣本的細胞懸液時，可能導致各樣本之間懸液制備間隔時間過長，此時則不建議一次完成多樣本建庫。
