豬偽狂犬病毒PCR檢測試劑盒用途 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）（Nsp2 1594~1680 變異株）反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）
檢測試劑盒，用于檢測豬血清和組織中的 PRRSV（Nsp2 1594~1680 變異株），適用于 PRRSV（Nsp2
1594~1680 變異株）的檢測、診斷和流行病學調查。
原理 利用離心柱內硅基質膜提取 RNA，在反轉錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引物為起點合
成與 RNA 模板互補的 cDNA 鏈。在 TaqDNA 聚合酶的作用下，經高溫變性、低溫退火、中溫延伸的
循環，使特異 DNA 段的拷貝數放大一倍。經過 35 次循環，最終使擴增 DNA 段放大了數百萬倍。
將擴增 DNA 段進行電泳，經染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到 DNA 段的擴增帶。

試劑盒的組成

保存期 本產品有效期為 6 個月。
需自備的物品
1．儀器：分析天平、離心機、PCR 擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、微
波爐、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調移液器（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL 一次性注射器、生理鹽水、瓊脂糖、500 mL 量筒、500 mL
錐形瓶、經焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理的滅菌 1.5mL 離心管和吸頭（10 µL、200 µL、1000 µL）、
滅菌雙蒸水。
豬偽狂犬病毒PCR檢測試劑盒注意事項
1．所有接觸病料的物品均應合理處置，以免污染實驗室。
2．PCR 整個試驗分配液區、模板提取區、擴增區、電泳區。流程順序為配液區→模板提取區→擴增
區→電泳區。嚴禁器材和試劑倒流。
3．所有試劑應在規定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應*融化，8000 rpm 離心 15 s，使
液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立即放
回-20 ℃。
4．在 RNA 提取過程中，避免 RNA 酶污染，盡量縮短操作時間。
5． 染色液低毒，操作時應戴上手套，避光保存，較長時間不使用請存放于 4℃，以免揮發變干。染
色液和上樣緩沖液使用前也請離心使液體沉于管底。
6．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
7．嚴格遵守操作說明可以獲得的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
8．反復凍融試劑將減低檢測靈敏度，建議在 3 次內用完，請嚴格按試劑盒說明書操作。
樣品制備
1 樣品采集：病死或撲殺的豬，取肺、扁桃體和腦等組織；待檢活豬，用注射器取血 5 mL。2～8 ℃
保存，送實驗室檢測。（要求送檢病料新鮮，嚴禁反復凍融。）
2 樣品處理：每份樣品分別處理。
2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g，用手術剪剪碎混勻后取 0.05 g 于
研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm 離心
2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.2 全血樣品處理：待血凝后取血清 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.3 陽性對照處理：取陽性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.4 陰性對照處理：取陰性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
操作步驟
1 病毒 RNA 的提取
1.1 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入裂解液 600 µL，充分顛倒混勻，室溫靜置 3～5
min。
1.2 將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質，以免離心時堵
塞吸附柱），13000 rpm 離心 30 s。
1.3 棄去收集管中液體，加入 600 µL 洗液，13000 rpm 離心 30 s。
1.4 重復步驟 1.3。
1.5 棄去收集管中液體，13000 rpm 空柱離心 2 min，以除去殘留的洗滌液。
1.6 將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液 50 µL，室溫靜置 1 min，13000 rpm 離
心 30 s，離心管中液體即為模板 RNA。
2 RT-PCR 擴增
每份總體積 20 µL，含 16.8 µL RT-PCR 反應液（用前混勻），1.2 µL 酶混合液，2 µL 模板 RNA。
例如：n 份樣品，配制 n+1 份，16.8×（n+1）RT-PCR 反應液，再加入 1.2×（n+1）酶混合液，
混勻后取 18 µL 分裝成 n 份，分別加入 2 µL 模板 RNA，加入礦物油 20 µL 覆蓋（有熱蓋的 PCR 擴增
儀不用加礦物油），作好標記。
在 PCR 擴增儀上進行以下程序：42 ℃ 45 min，94 ℃ 3 min；循環 94 ℃ 30s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30
s，共 35 次；再 72 ℃延伸 7 min。
3 電泳
稱 4 g 瓊脂糖放于 500 mL 錐形瓶中，加入 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液 200 mL（取 4 mL 50 倍
TAE 電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至 200 mL），于微波爐中熔解，再加入 10 µL 染色液混勻。在電泳槽
內放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將 PCR 擴增產物 10µL 點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以 110～120V
電壓于 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結果。
結果判定 陽性對照出現 278 bp 擴增帶、陰性對照無帶出現（引物帶除外）時，實驗結果成立。
被檢樣品出現 278 bp 或 200 bp 擴增帶為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Nsp2 1594~1680 變異株）陽性，
否則為陰性。