IL-4/IL-13響應(yīng)型STAT6熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系是一種穩(wěn)定整合了受STAT6響應(yīng)元件控制的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因和人類STAT6（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6）的HEK293細(xì)胞系，形成了一個(gè)w全功能的STAT6信號(hào)通路。該細(xì)胞系已通過(guò)人類IL-4（白細(xì)胞介素-4）和IL-13（白細(xì)胞介素-13）的激活實(shí)驗(yàn)以及使用抗IL-4R和抗IL-13R拮抗劑進(jìn)行了驗(yàn)證。

背景

轉(zhuǎn)錄因子STAT6（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6）在免疫細(xì)胞中扮演著至關(guān)重要的角色。IL-4激活的STAT6信號(hào)對(duì)于Th2分化和免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換是必需的，它還介導(dǎo)巨噬細(xì)胞中炎癥增強(qiáng)子的直接抑制。STAT6參與過(guò)敏性炎癥疾病的多個(gè)方面，如氣道高反應(yīng)性、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肥大細(xì)胞反應(yīng)。STAT6主要被IL-4和相關(guān)的IL-13激活，它們具有重疊的生物學(xué)特性。當(dāng)IL-4和IL-13結(jié)合時(shí)，由IL-4Ralpha和IL-13Ralpha1組成的受體復(fù)合物激活與受體相關(guān)的Janus激酶（JAK1和Tyk2），從而導(dǎo)致STAT6的激活。激活的STAT6形成同源二聚體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，在那里它們結(jié)合響應(yīng)基因的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄。盡管這兩種細(xì)胞因子都激活STAT6信號(hào)，但已證明IL-4在啟動(dòng)這一信號(hào)通路方面比IL-13更有效。STAT6通路的功能障礙會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)（哮喘、特應(yīng)性皮炎、食物過(guò)敏）和癌癥（霍奇金病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和濾泡性淋巴瘤）。STAT6可以作為診斷和預(yù)后工具。抑制劑已被證明可以減少動(dòng)物模型中的急性炎癥，未來(lái)的發(fā)展可能會(huì)導(dǎo)致新的針對(duì)STAT6相關(guān)病理的治療工具。

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應(yīng)用

? 篩選和表征STAT6信號(hào)通路的激活劑或抑制劑。

? 篩選抗IL-4、抗IL-4R、抗IL-13或抗IL-13R抗體。

細(xì)胞解凍

1. 在37°C水浴中搖晃裝有冷凍細(xì)胞的小瓶大約60秒。細(xì)胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將小瓶的全部?jī)?nèi)容轉(zhuǎn)移到含有10 ml預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基1的試管中。

注意：在37°C水浴中放置細(xì)胞過(guò)久將導(dǎo)致活性迅速喪失。

2. 立即以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞在5 ml預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基1中重懸。

3. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時(shí)后，檢查細(xì)胞附著和活性。更換培養(yǎng)基為新鮮的解凍培養(yǎng)基1，并繼續(xù)在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好傳代。

5. 細(xì)胞應(yīng)在w全融合前傳代。在s次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基1M。

細(xì)胞傳代

1. 抽去培養(yǎng)基，用無(wú)Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞，并用0.05% y酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基1M并轉(zhuǎn)移到試管中。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基1M中重懸。

4. 按照推薦的亞培養(yǎng)比例1:5至1:10，每周一次或兩次將細(xì)胞種入新的培養(yǎng)容器中。

注意：解凍后和細(xì)胞密度低時(shí)，細(xì)胞可能生長(zhǎng)速度較慢。在這些情況下，建議以1/4的比例分離細(xì)胞。經(jīng)過(guò)幾次傳代后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，可以使用更高的比例分離細(xì)胞。

細(xì)胞冷凍

1. 抽去培養(yǎng)基，用無(wú)Ca2+/Mg2+的PBS沖洗細(xì)胞，并用0.05% y酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基1M并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞在4°C冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸，細(xì)胞濃度約為2 x 10^6個(gè)細(xì)胞/ml。

4. 將1 ml的細(xì)胞懸浮液分裝到每個(gè)冷凍小瓶中。將小瓶放入保溫容器中緩慢冷卻，并在-80°C下保存過(guò)夜。

5. 次日將小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存。

注意：建議在早期傳代時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞并至少冷凍10個(gè)小瓶以備將來(lái)使用。

圖1：IL-4/IL-13響應(yīng)型STAT6熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系對(duì)人類IL-4和IL-13的反應(yīng)。

IL-4/IL-13響應(yīng)型STAT6熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞與不同濃度的人類IL-4（左圖）和IL-13（右圖）共培養(yǎng)6小時(shí)。使用ONE-Step?熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量熒光素酶活性。結(jié)果以STAT6熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的誘導(dǎo)倍數(shù)顯示，與無(wú)激動(dòng)劑的細(xì)胞活性相對(duì)比。

文獻(xiàn)參考：

Kasaian MT., et al., 2013. Am J Respir Cell Mol Biol. 49(1):37-46.

Czimmerer Z., et al., 2018. Immunity 48(1):75-90.e6. 

BPS Bioscience是一家通過(guò)ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動(dòng)新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)、CRISPR、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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IL-4/IL-13響應(yīng)型STAT6熒光素酶報(bào)告基因 IL-4/IL-13響應(yīng)型STAT6熒光素酶報(bào)告基因