用于細(xì)胞裂解液中Phospho-AKT 1/2/3（T308）的半定量檢測的夾心TR-FRET免疫分析試劑盒。完整的檢測驗證信息可在技術(shù)數(shù)據(jù)表中找到。詳細(xì)的檢測協(xié)議請參閱通用用戶手冊。

艾美捷BioAuxilium-THUNDER磷酸AKT pan(T308)TR-FRET細(xì)胞信號檢測試劑盒#KIT-AKTT308P-100組成：

Eu-Phospho-AKT T308（5 µL）

Acc-Phospho-AKT T308（20 µL）

AKT對照裂解液（100 µL）

5倍裂解緩沖液1（1 mL）

10倍TR-FRET檢測緩沖液（50 µL）

100倍磷酸酶抑制劑混合液（50 µL）

互補試劑：

THUNDER™ AKT泛抗體對照裂解液

THUNDER™裂解緩沖液1（5倍濃縮）

THUNDER™ TR-FRET檢測緩沖液（10倍濃縮）

驗證數(shù)據(jù)：

本試劑盒已通過驗證，可用于使用2-板檢測協(xié)議對NIH3T3細(xì)胞裂解液中Phospho-AKT泛抗體（T308）的相對定量檢測。

細(xì)胞培養(yǎng)：貼壁細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48小時（DMEM + 10% CBS）。

細(xì)胞處理：細(xì)胞處理后，移除培養(yǎng)基，用1X裂解緩沖液1（50 µL）裂解細(xì)胞，裂解緩沖液中補充了磷酸酶抑制劑（1 mM氟化鈉和2 mM焦磷酸鈉）。

孵育與檢測：在室溫下于振蕩器（400 rpm）孵育30分鐘后，將裂解液（15 µL）轉(zhuǎn)移至384孔檢測板，并加入標(biāo)記抗體Eu-Ab1和FR-Ab2（5 µL）用于檢測Phospho-AKT泛抗體（T308）。

信號讀取：在室溫孵育4小時后，記錄665 nm和615 nm處的TR-FRET信號（EnVision®；燈激發(fā)）。

實驗數(shù)據(jù)：

NIH3T3細(xì)胞（每孔30,000個細(xì)胞，三重復(fù)）在室溫下與PDGF-AA的系列稀釋液孵育15分鐘。數(shù)據(jù)顯示，PDGF-AA處理可刺激NIH3T3細(xì)胞中AKT在T308位點的磷酸化。

NIH3T3細(xì)胞（每孔30,000個細(xì)胞，三重復(fù)）在室溫下與Wortmannin的系列稀釋液孵育30分鐘，隨后用1 nM PDGF-AA刺激15分鐘。數(shù)據(jù)顯示，Wortmannin處理可抑制PDGF-AA誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞中AKT在T308位點的磷酸化。

NIH3T3細(xì)胞（每孔30,000個細(xì)胞）在室溫下分別用不含或含3 nM PDGF-AA的溶液孵育15分鐘。使用每組處理的48個孔來確定Z'因子值。Z'因子值為0.7，表明該檢測方法穩(wěn)健且適用于高通量篩選（HTS）。

質(zhì)量控制：Phospho-AKT泛抗體（T308）試劑盒常規(guī)測試使用PDGF-AA處理的NIH3T3裂解液。NIH3T3細(xì)胞在T175培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至95%匯合，用3 nM PDGF-AA在室溫下刺激15分鐘。細(xì)胞裂解后，用1X裂解緩沖液1對裂解液進(jìn)行系列稀釋，并進(jìn)行三重復(fù)檢測。數(shù)據(jù)顯示，裂解液稀釋度與TR-FRET比值呈線性關(guān)系。

艾美捷科技是BioAuxilium的中國區(qū)域合作伙伴，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。