小伙伴們在上篇學習了ELISA實驗的原理、類型，并且根據自己的需求選擇了適合自己的試劑盒，那接下來就是ELISA的實操了，包括哪些實驗步驟和注意事項呢？快來和小愛一探究竟吧！
ELISA實驗步驟
圖1 ELISA標準實驗流程
1、樣本采集：
a）血漿：采集血漿時可使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血劑。采集后30min內，1000xg離心15min。立即檢測或分裝后于≤-20℃儲存。避免反復凍融。
b）細胞培養上清液：通過離心去除顆粒，立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。避免反復凍融。
c）細胞裂解液：在裂解緩沖液中裂解細胞并將其放在冰上靜置30min。14,000xg離心5min除去不溶物。將上清液轉移至新管中利用總蛋白分析法定量總蛋白濃度。立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。
d）乏血小板血漿：在采集血漿時可使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血劑。采集后30min內，1000xg離心15min。建議在2-8°C下，10,000xg再次離心10min，以便去除血小板。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復凍融。
e）血清：使用不含抗凝劑的收集管，讓樣品在室溫下凝結30min，然后1000xg離心15min。立即取出血清并進行檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復凍融。
f）唾液：將唾液收集到管中，10,00xg離心5min。收集水相，立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。避免反復凍融。
g）尿液：無菌進行當天shou次尿液的采集(中段尿)，直接排入無菌容器中。離心去除不溶顆粒物質。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復凍融。
h）母乳：2-8°C，1000xg離心15min。重復進行水相部分的收集，總共3次。立即檢測。
i）組織勻漿液：制備方法因組織類型而異。用1XPBS緩沖液沖洗以除去多余血液，使用20mL 1XPBS進行勻漿，并于≤-20°C下儲存過夜。將勻漿液凍融兩次以便破壞細胞膜，然后5000xg離心5min。去除上清液后立即進行檢測，或者分裝后于≤-20°C儲存。避免反復凍融。
j）組織裂解液：用PBS沖洗組織，將組織切成1-2mm的薄片，用組織勻漿器在PBS中進行勻漿。加入等體積的含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液，在室溫下裂解組織30min，裂解過程中輕搖裂解液。離心去除沉淀。利用總蛋白質分析法定量總蛋白的濃度。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。
2、預實驗
ELISA實驗中進行預實驗是非常有必要的，一方面為了檢測試劑盒是否好用，標曲擬合線性是否良好，最高OD值是否能達到2.0左右，是否存在假陽性假陰性；另外一方面為了檢測樣本最佳稀釋比例，樣本濃度過高要進行稀釋；樣本濃度過低要選擇超敏試劑盒。
3、ELISA實驗對照
1）空白對照：提供背景信號參考，并確保讀取值表示樣品中的分析物濃度。
2）陽性對照：已知含有目標蛋白的內源性可溶樣品，或已知含有檢測抗體免疫原的純化蛋白或多肽來作為陽性對照。當樣品的檢測結果為陰性時，陽性對照的陽性結果可表明實驗過程無誤且有效，所以實驗的陰性結果是真實的。
3）陰性對照：已知不表達目標蛋白的樣品。其有助于檢測非特異性結合和假陽性結果。
4）標準品：含有已知濃度的目標蛋白的樣品，可從中獲得標準曲線。
5）樣本基質中的標準品（加標對照品）：加標對照可用來給出有關某種特殊樣品基質中分析物發現程度的信息，從而表明檢測性能。比如，在ELISA 中檢測血清樣品時，按照慣例標準品用正常稀釋緩沖液來稀釋。但可以同時用檢測的種屬血清來稀釋標準品。
4、實驗步驟（以Human IL-6 ELISA Kit – Absin，abs510003）
1）準備好所有需要的試劑和標準品；
2）從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔，未用的板條請放回鋁箔袋內，重新封口；
3）向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30s，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4）分別將不同濃度標準品，實驗樣本或者質控品加入相應孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2h;
5）將板內液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內洗滌液吸去。重復操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結果。最后一次洗板結束，請將板內所有液體吸干或將板倒置，在吸水紙拍干所有殘留液體；
6）在每個微孔內加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2h；
7）重復第5步洗板操作；
8）在每個微孔內加入100uL SA-HRP，室溫孵育20min。注意避光；
9）重復第5步洗板操作；
10）在每個微孔內加入100uL顯色液，室溫孵育5-30min，注意避光；
11）在每個微孔內加入50uL終止液，孔內溶液顏色會從藍色變為黃色。如果溶液顏色變為綠色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12）加入終止液后30min內，使用酶標儀測量450nm的吸光度值，設定570nm或630nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結果準確度可能會受影響；
13）計算結果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值（OD450-OD540或OD570）、復孔讀數取平均值，然后減去平均零標準品OD值。使用計算機軟件作四參數邏輯(4-PL)曲線擬合創建標準曲線。另一種方法是，可以通過繪制標準品濃度做對數與相應OD值對數生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數據擬合。若樣本經過稀釋，計算濃度時應乘以稀釋倍數。
ELISA操作小技巧
圖2 ELISA操作小技巧
ELISA常見問題
常見問題 | 原因 | 解決方法 |
無信號或信號低，但標準曲線正常 | 樣本中無目標分子或目標分子濃度低于試劑盒檢測范圍 | 更換可以檢測濃度更低的試劑盒或對樣本進行濃縮 |
樣本中的基質效應干擾了目標蛋白與抗體結合 | 用適當的稀釋液對樣本進行濃縮梯度處理，檢測稀釋的線性度是否良好，設置加標對照品 | |
標準品和樣品都無信號或信號低 | 標準品問題；標準品毀壞(樣品孔有信號)；標準品重溶方法是否正確 | 重新使用一瓶新的標準品，待標準品恢復室溫后，按照說明書加入提及的稀釋液，充分溶解15min |
顯色試劑是否有效；顯色時間不充足 | 進行color test；增加顯色時間 | |
實驗條件與操作問題 | 孵育溫度，時間，是否需要振蕩器，酶標儀是否設置正確等 | |
信號強 | 樣本中檢測分子的濃度高，超出試劑盒檢測范圍 | 對樣本進行適當的稀釋 |
洗滌不充分，殘留有未結合的過氧化物酶 | 按照說明書進行充分洗滌(洗板機，增加洗滌次數) | |
板孔有干掉的情況 | 洗滌和加樣的過程中速度要快一些 | |
顯色液、終止液未及時使用 | 顯色液、終止液盡量現配現用 | |
CV值高或者重復性差 | 洗板不規范導致washing buffer殘留，使后加的反應試劑濃度不穩定 | 洗滌步驟嚴格按照說明書操作 |
顯色試劑不穩定，各板孔的抗體不穩定，不均一 | 盡量選擇質量有保障的試劑盒 | |
實驗溫度問題 | 保持溫度適當且無明顯變化 | |
實驗操作問題 | 嚴格要求操作細節 |
Absin產品線：
爆款產品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測)；細胞培養(類器官試劑盒+基質膠，胎牛血清+培養添加劑+細胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
特色產品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
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