細胞的傳代培養

一. 傳代前準備：
1.預熱培養用液：把已經配制好的裝有培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。
2.用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。
3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。
4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。
5.準備好將要使用的消毒后的空培養瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次消毒。
6.取出預熱好的培養用液：取出已經預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。
7.從培養箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。
8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。

二.胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：小心吸出舊培養液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞，*消化溫度是37℃。
2. 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。
3.吸棄消化液加入培養液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養液。

三.吹打分散細胞：
1.吹打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。
2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。
3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉/分鐘離心6-8分鐘。
4.棄上清液，加入新培養液：棄去上清液，加入2ml培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

四.分裝稀釋細胞：
1.分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。
2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml。zui后要做好標記。

五.繼續培養：
用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上