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利用限制性核酸內切酶切割DNA和利用DNA連接酶連接DNA是DNA重組過程中的關鍵步驟之一。成功的酶切和有效的連接為后續的外源基因進入宿主細胞進行表達提供了有效的實驗材料。
實驗方法
- 質粒DNA酶切
- DNA段連接
| 實驗方法原理 | 限制性內切酶能夠特異性地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異性位點上，并切割雙鏈DNA。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 標準pUC19（2686bp） |
| 試劑、試劑盒 | EcoRI及其配套的酶切緩沖液 0.5×TBE電泳緩沖液 6×Loading Buffer Goldview 瓊脂糖 |
| 儀器、耗材 | 水平電泳儀 水浴鍋 移液器 微波爐 成像設備 |
| 實驗步驟 | 1.在200ul的離心管中，按照下表加入試劑（單位：ul），混勻；點動離心將反應液甩至管底。37℃保溫2h進行酶切反應。  2.反應結束后，加入2ul 10×Loading Buffer鈍化酶活性；（或：65℃，保溫20min使酶失活）。 3.電泳檢測。 酶切陰性對照：pUC19標樣+10×Loading Buffer 2ul 酶切樣品：標準pUC19酶切樣品10ul + 10×Loading Buffer 2ul 4.質粒及酶切樣品電泳預期結果。  |
| 注意事項 | 影響酶切的因素：在酶切反應中，DNA的純度、緩沖液中的離子強度、Mg2+等因素均可影響反應，一般可通過增加酶的用量，延長反應時間等措施以達到*酶切。但應注意的是，過多的酶量和過長的反應時間會造成非特異性的酶切（星號活性） |
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