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DNA專題:真核細胞基因組提取

2013-7-27  閱讀(1475)

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一. 實驗目的及背景
       高等動物,高等植物的基因組相當龐大, 如人類細胞基因組由30億個堿基對組成,果蠅基因組有1.4×108個堿基對,水稻基因組有1.4×109個堿基對。真核細胞基因組中,約1萬-1.5萬個可表達的結構基因,其它大量存在的是調控序列和內含子序列。可以說某特定物種的基因組,包含了該物種生長,發育,繁殖等各項生理活動的幾乎全部信息量,因而對真核細胞基因組的結構,組成,以及表達調控的研究是至關重要的,而研究的起點就是要獲得純度高--不含蛋白質、糖類、酚、氯仿等污染;得率好--以便有足夠量用于分析;基因組相對完整--斷裂的基因組以便用于以后PCR分析,RFLP分析,基因文庫的構建,基因探測等的研究。
      真核細胞基因組在提取過程中一般有以下幾步,首先是機械法破細胞抽提;然后去除蛋白質,糖類等細胞內雜質污染;zui后純化出DNA,由于真核細胞基因組較大,在操作中應注意動作輕柔,且在低溫下進行,以zui大限度地減少機械和化學作用對DNA的剪切,從而獲得相對完整的DNA。

      二.實驗試劑及材料
      材料:幼嫩的植物材料0.5g左右。
      試劑:液氮
      CTAB抽提緩沖液:2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide, 十六烷基*基溴化銨),1%β-巰基乙醇 1.4mol/L Nacl,20mmol/L EDTA,100mmol/L Tris-Hcl pH8.0
      3M NaAC
      50mM Tris-HCl pH8.0
      20mM EDTA
      氯仿:異戊醇(24:1)
      異丙醇 70%乙醇TE buffer


三.實驗方法
      1.取0.5g植物材料,雙蒸水洗凈,并用濾紙吸干。
      2.植物材料剪成1cm左右碎片,放入預冷的瓷研缽中。
      3.加入液氮速冷,研磨成細粉(越細越好)。
      4.在5ml離心管中加入抽提緩沖液2.5ml,60℃保溫1小時。
      5. 15000rpm,離心10分鐘。上清轉入另一個新的離心管中。
      6.加入等體積氯仿:異戊醇(24:1),混勻抽提至水乳膠融狀。
      7. 15000rpm,離心10分鐘。
      8.上清轉入另一個新的離心管中。
      9.加入2/3倍體積預冷異丙醇,-20℃保溫30min―1hr,緩緩混勻DNA成絮狀折出。
      10.15000rpm,離心10分鐘,棄上清。
      11.DNA沉淀用 70%乙醇洗2次。
      12.加入400μl TE buffer溶解DNA。
 

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