許多高溫DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等擴增的PCR產物在3’-末端后都帶有一個突出的堿基A，這樣的PCR產物可以用3’-末端后帶有一個突出堿基T的載體方便地進行克隆。
pBLUE -T 載體克隆試劑盒 T4原理載體及其他

pBLUE -T 載體克隆試劑盒

pBLUE -T 載體克隆試劑盒 T4原理載體及其他

目錄號：42014

試劑盒組成、儲存、穩定性：

－20℃儲存，6個月內不影響使用效果。

產品介紹：

許多高溫DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等擴增的PCR產物在3’-末端后都帶有一個突出的堿基A，這樣的PCR產物可以用3’-末端后帶有一個突出堿基T的載體方便地進行克隆。pBLUE-T 載體來源于pBlueScript II SK(+) 質粒，在EcoRI酶切位點處添加了適當序列，經XCM I 酶切后其3’末端直接產生未配對的T堿基而成，因此有更高的重組效率。pBLUE-T 載體插入位點兩端du特設計的兩個ECOR I位點使插入片段可以用廉價高效的ECOR I單酶切檢測； 同時pBLUE-T 載體不含NdeI或NcoI限制性內切酶位點，可方便用于克隆含上述酶切位點的基因。此外，本公司載體連接體系還有背景低（藍斑小于10%），重組率高（白斑中超過90%有插入片段），可快速連接等特點。本說明書末列出了pBLUE-T 載體相關的技術資料，其全序列可參照pBlueScript II SK(+)序列，只是其多克隆酶切位點處序列稍有不同。

測序可以采用T3、T7啟動子引物和M13通用測序引物（見后面圖譜）

操作步驟：

1. 連接反應的準備：

PCR產物是否要進行純化取決于擴增產物的質量。如果PCR產物非常干凈，不經純化就可直接進行連接反應。但如果是以質粒為模板的PCR產物則必須進行純化，模板質粒有可能也形成白斑。PCR產物可以通過瓊脂糖凝膠電泳分離。本公司生產的DNA產物快速純化回收試劑盒對70bp以上的DNA片段能很好地進行回收。

Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶擴增的PCR產物，其末端都帶有一個突出的3’ -A。 具有3’ -A末端的PCR產物可以直接用pBLUE-T 載體進行克隆連接。具有3’®5’外切酶活性的DNA聚合酶（高保真酶）擴增的PCR產物是平末端，要對這種平末端PCR產物進行克隆，應先進行3’-端加A工作。

2. 常規連接反應：

1) 在一個標準的10 ml連接反應體系中，加入1 ml 30ng pBLUE-T 載體、X ml PCR產物(在通常狀況下，沒有必要對PCR產物進行精確定量，一般PCR產物與載體的摩爾比優化至2:1~10:1就可以得到良好結果，推薦3:1)、1ml 10′ligation Buffer和0.5-1ml (2.5 -5 Weiss Units)的T4 DNA Ligase，其余用水補足。反應按以下體系進行：

一般最后加入T4 DNA Ligase。

2) 16℃連接過夜（一般可在PCR儀器完成）。

通常推薦16℃連接過夜（10ml體系標準連接酶量為2.5 Weiss Units即可），可以得到最多的轉化子。但是本系統含PEG Enhancer可以提高連接效率數倍，在高連接酶量的情況下（10ml體系推薦連接酶量為5 Weiss Units）16℃連接30分鐘即可達一般研究的要求。

3) 冰上冷卻，然后轉化或貯存于-20℃。

3. 快速連接反應：

1) 反應按以下體系進行：

一般最后加入T4 DNA Ligase。

2) 22℃連接5-10分鐘（一般可在PCR儀器完成）。

2 ′Quick Ligation Buffer已經包含所有優化的快速連接成份，通常推薦22℃連接10分鐘（10ml體系連接酶量為5 Weiss Units，長片段連接可以延長至30分鐘）一般可以得到滿意結果。此外本系統也可在16℃連接30分鐘（10ml體系連接酶量為5Weiss Units）即可達一般研究的要求。

3) 冰上冷卻，然后轉化或貯存于-20℃。

4. 轉化：

e50-100ml感受態細胞，置于冰上，wan全解凍后輕撣幾次將細胞均勻懸浮。

e加入4－5ml連接液(最多可全部加入，只要體積不超過感受態細胞體積的1/10)，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。42℃水浴熱激90秒。冰上放置2~3分鐘。

e加500ml LB或者SOC培養基(不含抗生素)，37℃ 150 rpm振蕩培養60分鐘。

e將200ml細菌涂布在預先用16ml 50mg/ml IPTG和40ml 20 mg/ml X-gal 涂布的氨芐青霉su平板上。

涂布細菌的用量依連接的效率及感受態細胞的感受率而進行適當的調整，如果 預計的克隆較少，可通過離心（4,000rpm，2 分鐘）后吸除部分培養液，留下適量的培養基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個平板中（涂布剩余的菌液可以擱在4度保存，第2天如果轉化菌落數量少，可將剩余菌液全部涂一個新培養板)。

e平板在37℃下正向放置1小時以吸收過多的液體，然后倒置培養過夜。
5 篩選：

1). 轉化子的藍白篩選：

當外源DNA片段插入到pBLUE-T 中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產物b-半乳糖苷酶a-片段的活性，因此重組克隆在X-gal/IPTG平板上呈現為白色，而非重組克隆呈藍色。有的時候插入片段沒有影響lacZ 基因讀碼框， 或插入片段太小，這種情況下菌落（重組克隆）呈現淡藍色或者在菌落中心呈現淡藍斑點，外圈白色（魚眼狀藍斑fish eye）。選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落或者淡藍色菌落，用牙簽挑至含氨芐青霉su的液體培養基，37℃培養過夜。
2). 轉化子的鑒定：

a. 用上述培養的白色菌落的菌液抽提質粒，用ECOR I 單酶切或用其它合適的酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段。

b. 挑取白色菌落直接進行PCR檢測（可參見分子克隆第3版本或者咨詢我們）

c. 用T3和T7啟動子引物或其它合適的引物測序來確定是否含有目的克隆。

如何計算連接反應中需要的PCR產物的量?

一般PCR產物與載體的摩爾比優化至2:1~10:1（推薦3:1）就可以得到良好結果，可采用以下公式：

[加入載體的量（ng）×插入片段大小（kb）÷載體大小（kb）]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量（ng） 例如：插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1，如連接反應中加入載體40ng，插入片段大小為1000bp，這時應加入插入片段的量為[40ng載體×1kb插入片段÷2.984kb載體]×3/1=40.2ng。 

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