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北京諾博萊德科技有限公司

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42119pBLUE-T Simple載體快速克隆試劑盒 T4原理

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  • 北京諾博萊德科技有限公司
  • 2025-04-24 08:13:13
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【簡單介紹】

品牌 NobleRyder/諾博萊德 貨號 42119
規(guī)格 20次/60次 供貨周期 現(xiàn)貨
主要用途 pBLUE-T Simple載體快速克隆試劑盒 應用領域 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,制藥/生物制藥
pBLUE-T Simple Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物 (TA Cloning) 的專用載體。這種載體是由pBlueScript II SK(+)質(zhì)粒改建而成,和傳統(tǒng)T載體ECOR V切開后加T方法不同
pBLUE-T Simple載體快速克隆試劑盒 T4原理

【詳細說明】

pBLUE-T Simple載體快速克隆試劑盒


pBLUE-T Simple載體快速克隆試劑盒 T4原理

目錄號:42119

試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性:

試劑盒組成

20次

(42119-20)

60次

(42119-60)

pBLUE-T Simple Vector(30ng/ml)

20ml

60ml

1000bp Control(30ng/ml)

5ml

5ml

10 PEG Enhancer

50ml

150ml

10 x Ligation Buffer

40ml

120ml

2 Quick Ligation Buffer

100ml

300ml

T4 DNA ligase, 5U/ml

20ml

60ml

-20℃儲存,6個月內(nèi)不影響使用效果。

產(chǎn)品介紹:

pBLUE-T Simple Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物 (TA Cloning) 的專用載體。這種載體是由pBlueScript II SK(+)質(zhì)粒改建而成,和傳統(tǒng)T載體ECOR V切開后加T方法不同,pSURE-T Simple 通過改造pBlueScript II SK(+),在原pBlueScript II SK(+)多克隆位點引入 Xcm I酶切后使其原多克隆位點兩側的3’末端直接產(chǎn)生未配對的T堿基,因此有更高的重組效率。同時它消除了pBlueScript II SK(+)載體上的多克隆酶切位點,需要在PCR擴增引物上導入合適的酶切位點。此時如果使用PCR擴增引物導入的酶切位點進行DNA酶切時,酶切反應將不會受到T載體上其它多克隆酶切位點上的限制酶影響,可以大大提高酶切效率,增加亞克隆成功率。此外,本公司載體連接體系還有背景低(藍斑小于10%),重組率高(白斑中超過90%有插入片段),可快速連接等特點。本說明書末列出了pBLUE-T Simple 載體相關的技術資料,其全序列可參照pBlueScript II SK(+)序列,只是其多克隆酶切位點處序列稍有不同。

測序推薦采用M13通用測序引物和T3啟動子引物(見后面圖譜)
操作步驟:
1.連接反應的準備

PCR產(chǎn)物是否要進行純化取決于擴增產(chǎn)物的質(zhì)量。如果PCR產(chǎn)物非常干凈,不經(jīng)純化就可直接進行連接反應。但如果是以質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物則必須進行純化,模板質(zhì)粒有可能也形成白斑。PCR產(chǎn)物可以通過瓊脂糖凝膠電泳分離。本公司生產(chǎn)的DNA產(chǎn)物快速純化回收試劑盒對70bp以上的DNA片段能很好地進行回收。

Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物,其末端都帶有一個突出的3’ -A。 具有3’ -A末端的PCR產(chǎn)物可以直接用pBLUE-T Simple 載體進行克隆連接。具有3’®5’外切酶活性的DNA聚合酶(高保真酶)擴增的PCR產(chǎn)物是平末端,要對這種平末端PCR產(chǎn)物進行克隆,應先進行3’--端加A工作。

2.    常規(guī)連接反應:

1)   在一個標準的10 ml連接反應體系中,加入1 ml 30ng pBLUE-T Simple載體、X ml PCR產(chǎn)物(在通常狀況下,沒有必要對PCR產(chǎn)物進行精確定量,一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至2:1~10:1就可以得到良好結果,推薦3:1)、1ml 10ligation Buffer和0.5-1ml (2.5 -5 Weiss Units)的T4 DNA Ligase,其余用水補足。反應按以下體系進行:

1ml

10Ligation Buffer (用前充分融解混勻)

1ml

10 PEG Enhancer

1ml

pBLUE-T Simple Vector

Xml

純化后的PCR產(chǎn)物/或者1ml 1000bp control

Yml

無菌水

0.5-1ml (5 Weiss Units/ml)

T4 DNA Ligase

Final Volume

10ml

一般最后加入T4 DNA Ligase。

2)   16℃連接過夜(一般可在PCR儀器完成)。

通常推薦16℃連接過夜(10ml體系標準連接酶量為2.5 Weiss Units即可),可以得到最多的轉化子。但是本系統(tǒng)含PEG Enhancer可以提高連接效率數(shù)倍,在高連接酶量的情況下(10ml體系推薦連接酶量為5 Weiss Units)16℃連接30分鐘即可達一般研究的要求。

3)   冰上冷卻,然后轉化或貯存于-20℃。

3. 快速連接反應:

1)   反應按以下體系進行:

5ml

2 Quick Ligation Buffer (用前充分融解混勻)

1ml

pBLUE-T Simple Vector

Xml

純化后的PCR產(chǎn)物/或者1ml 1000bp control

Yml

無菌水

1ml (5 Weiss Units/ml)

T4 DNA Ligase

Final Volume

10ml

一般最后加入T4 DNA Ligase。

2)   22℃連接5-10分鐘(一般可在PCR儀器完成)。

2 Quick Ligation Buffer已經(jīng)包含所有優(yōu)化的快速連接成份,通常推薦22℃連接10分鐘(10ml體系連接酶量為5 Weiss Units,長片段連接可以延長至30分鐘)一般可以得到滿意結果。此外本系統(tǒng)也可在16℃連接30分鐘(10ml體系連接酶量為5 Weiss Units)即可達一般研究的要求。

3)   冰上冷卻,然后轉化或貯存于-20℃。

4.   轉化:

e 50-100ml感受態(tài)細胞,置于冰上,wan全解凍后輕撣幾次將細胞均勻懸浮。

e 加入4-5ml連接液(最多可全部加入,只要體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10),輕輕混勻。冰上放置30分鐘。42℃水浴熱激90秒。冰上放置2~3分鐘。

e 加500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素),37℃ 150 rpm振蕩培養(yǎng)60分鐘。

e  將200ml細菌涂布在預先用16ml 50mg/ml IPTG和40ml 20 mg/ml X-gal 涂布的氨芐青霉su平板上。

涂布細菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細胞的感受率而進行適當?shù)恼{(diào)整,如果 預計的克隆較少,可通過離心(4,000rpm,2 分鐘)后吸除部分培養(yǎng)液,留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個平板中(涂布剩余的菌液可以擱在4度保存,第2天如果轉化菌落數(shù)量少,可將剩余菌液全部涂一個新培養(yǎng)板)。

e  平板在37℃下正向放置1小時以吸收過多的液體,然后倒置培養(yǎng)過夜。

5     篩選:

1). 轉化子的藍白篩選:

當外源DNA片段插入到pBLUE-T Simple 中后,由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼,從而影響了其產(chǎn)物b-半乳糖苷酶a-片段的活性,因此重組克隆在X-gal/IPTG平板上呈現(xiàn)為白色,而非重組克隆呈藍色。有的時候插入片段沒有影響lacZ 基因讀碼框, 或插入片段太小,這種情況下菌落(重組克?。┏尸F(xiàn)淡藍色或者在菌落中心呈現(xiàn)淡藍斑點,外圈白色(魚眼狀藍斑fish eye)。選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落或者淡藍色菌落,用牙簽挑至含氨芐青霉su的液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)過夜。

2).  轉化子的鑒定:

a.     用上述培養(yǎng)的白色菌落的菌液抽提質(zhì)粒,用插入片段所帶酶切位點酶切,瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小,確定是否含有目的片段。

b.     挑取白色菌落直接進行PCR檢測

c.     用T3啟動子引物或M13通用測序引物測序來確定是否含有目的克隆。

e 如何計算連接反應中需要的PCR產(chǎn)物的量?

一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至2:1~10:1(推薦3:1)就可以得到良好結果,可采用以下公式:

[加入載體的量(ng)×插入片段大?。╧b)÷載體大小(kb)]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量(ng) 例如:插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1,如連接反應中加入載體40ng,插入片段大小為1000bp,這時應加入插入片段的量為[40ng載體×1kb插入片段÷2.928kb載體]×3/1=40.1ng。

pBLUE-T Simple載體快速克隆試劑盒 T4原理


    
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