目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC5465-100T/48S磷酸轉乙酰酶（PTA）活性檢測試劑盒
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 100T/48S |
| 貨號 | BC5465 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農業,綜合 |
| 主要用途 | 磷酸轉乙酰酶（PTA）活性檢測 |
磷酸轉乙酰酶（PTA）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC5465
規格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體1.2 mL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體1.3 mL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1. 試劑四：臨用前取1支試劑四，加入0.6 mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融（1支試劑四溶解后可做60S，為了延長試劑盒使用時間，此產品多給1支粉劑）。
產品說明：
磷酸轉乙酰酶（Phosphotransacetylase，PTA，EC 2.3.1.8）是與乙酸代謝相關的關鍵酶之一，乙酸在乙酸激酶和磷酸轉乙酰酶的作用下生成乙酰輔*A，以此來連接糖類、脂肪、蛋白質三大營養物質的代謝通路-三羧酸循環和氧化磷酸化。PTA催化乙酰輔*A和無機磷反應生成輔*A和乙酰磷酸，該反應促使DTNB轉變成黃色的TNB，其在412nm處有特征吸收峰。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、分析天平、低溫離心機、水浴鍋、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、可調節移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。
2. 細菌/細胞：按照細菌/細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌/細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔7秒，總時間5min）；然后12000rpm，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。
二、測定步驟
1. 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至412nm，分光光度計蒸餾水調零。
2. 試劑一于25℃預熱10min左右。
3. 操作表：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 |
試劑一 | 120 | 130 |
試劑二 | 10 | 10 |
試劑三 | 10 | 10 |
樣本 | 50 | 50 |
試劑四 | 10 | - |
將上述試劑按順序加入微量玻璃比色皿/96孔板中，充分吸打混勻，記錄412nm波長下15秒時的初始吸光度A1，比色后迅速將比色皿連同反應液一起放入25℃水浴準確反應2分鐘（若酶標儀帶有控溫功能，將溫度調至25℃）；迅速取出比色皿并擦干，記錄412nm波長下2分15秒時的吸光度A2，并計算ΔA測定=A2測定-A1測定，ΔA對照=A2對照-A1對照，ΔA=ΔA測定-ΔA對照。每個測定管需設置一個對照管。
三、磷酸轉乙酰酶（PTA）活性計算
1. 使用微量玻璃比色皿測定：
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：25℃下每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。
PTA活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷（Cpr×V樣本）÷T=147.059×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本質量計算
單位的定義：25℃下每g組織在反應體系中每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。
PTA活性（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷（W×V樣本÷V提取）÷T=147.059×ΔA÷W
（3） 按細菌/細胞計算
單位的定義：25℃下每106個細菌/細胞在反應體系中每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。
PTA活性（U/106 cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷（N×V樣本÷V提取）÷T=147.059×ΔA÷N
ε：TNB摩爾消光系數，13.6×10-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，0.2mL； V樣本：反應體系中加入的樣本體積，0.05mL；V提取：加入提取液的體積，1mL；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細菌或細胞總數，以106計。
2. 使用96孔板測定：
將上述公式中的d=1cm改為d=0.6cm（96孔板光徑）進行計算即可。
注意事項：
1. 測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失效。
2. 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。
3. 樣本較多時，可根據樣本數量按操作表配制工作液（試劑一、二、三），因通過單位時間內吸光值變化計算酶活，不推薦同時測多個樣本。
4. 如果樣本ΔA過低，可適當加大樣本量后重新測定；如果樣本ΔA大于0.6（微量比色皿）或者0.4（96孔板），建議將樣本用提取液適當稀釋后進行測定。注意同步修改計算公式。
實驗實例：
1. 取0.1056g成熟梨果肉樣本，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用微量玻璃比色皿測得計算：ΔA測定=A2測定-A1測定=0.1013-0.0620=0.0393，ΔA對照=A2對照-A1對照=0.0571- 0.0558=0.0013，ΔA=ΔA測定-ΔA對照=0.0393-0.0013=0.0380，按樣本質量計算酶活得：
PTA活性（U/g 質量）=147.059×ΔA÷W= 147.059×0.0380÷0.1056=52.919 U/g 質量。
2. 取5.76×106個細胞，加入0.8mL提取液進行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用微量玻璃比色皿測得計算：ΔA測定=A2測定-A1測定=0.2411-0.1402=0.1009，ΔA對照=A2對照-A1對照=0.1775-0.1037= 0.0738，ΔA=ΔA測定-ΔA對照=0.1009-0.0738=0.0271，按細胞數量計算酶活得：
PTA活性（U/106 cell）=0.0271÷（13.6×10-3×1）×0.2÷（5.76×0.05÷0.8）÷2=0.554 U/106 cell。
參考文獻：
[1] Michael M, Karin B, Wolfgang S, et al. Isolation and properties of acetate kinase- and phosphotransacetylase- negative mutants of Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus [J]. Microbiology, 1995, 141(11): 2891-2896.
[2] Miyake M, Kataoka K, Shirai M, et al. Control of poly-beta-hydroxybutyrate synthase mediated by acetyl phosphate in cyanobacteria[J]. Journal of Bacteriology, 1997, 179(16): 009-5013.
[3] Bock AK, Glasemacher J, Schmidt R, et al. Purification and characterization of two extremely thermostable enzymes, phosphate acetyltransferase and acetate kinase, from the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga maritima[J]. Journal of Bacteriology, 1999, 181(6): 1861-1867.
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