規格:20T/50T/100T,價格：400/700/1200元，產品簡介

       Annexin是一類廣泛分布于真核細胞細胞漿內鈣離子依賴的磷酯結合蛋白，參與細胞內的信號轉導。Annexin V選擇性結合磷酯酰***(phosphatidylserine，簡稱PS)。****主要分布在細胞膜內側，即與細胞漿相鄰的一側。在細胞發生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把***酸外翻到細胞表面，即細胞膜外側。***氨酸暴露到細胞表面后會促進凝血和炎癥反應。而Annexin V和外翻到細胞表面的磷***酸結合后可以阻斷***的促凝血和促炎癥反應活性。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。用帶有綠色熒光的熒光探針FITC標記的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式細胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷酯***酸的外翻這一細胞凋亡的重要特征。       Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)是用FITC標記的重組人Annexin V來檢測細胞凋亡時出現在細胞膜表面的磷***酸的一種細胞凋亡檢測試劑盒。可以使用流式細胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設備進行檢測。      本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞，呈現紅色熒光。對于壞死細胞，由于細胞膜的完整性已經喪失，Annexin V-FITC可以進入到細胞漿內，與位于細胞膜內側的磷酯***酸結合，從而也使壞死細胞呈現綠色熒光。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。

試劑盒組份 20 assays  50 assays 100 assays

Annexin V-FITC 100μL 250μL 500μL 4℃避光

結合液 15 mL 40 mL 75 mL 4℃

碘化丙啶 （PI） 100μL 250μL 500μL 4℃避光

試劑盒以外自備儀器和試劑

流式細胞儀或熒光顯微鏡、低速離心機、移液器、1.5m L離心管、載玻片、蓋玻片、PBS、不含EDTA的****  

操作步驟

1、對于懸浮細胞：A、在進行完細胞凋亡刺激后，1000g (約1000-2000rpm) 離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。（注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細胞的作用，可以保證后續Annexin V-FITC的結合。）B、取1~5×105重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，注意要把PBS吸干凈，（選做步驟：加入250ul的結合液輕輕重懸細胞，1000g離心5分鐘，棄上清）加入500µl 結合液輕輕重懸細胞。        C、加入5µl Annexin V-FITC，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。        D、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進行避光。E、隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞即可檢測。2、對于貼壁細胞：A、把細胞培養液吸出至一合適離心管內，PBS洗滌貼壁細胞一次，用**細胞消化液(最好不用含有EDTA)消化細胞。（注：**消化時間不易過長，否則容易引起假陽性）B、細胞消化下來后，加入步驟2A中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離心管內，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。。C、取1~5×105重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，注意要把PBS吸干凈，（選做步驟：加入250ul的結合液輕輕重懸細胞，1000g離心5分鐘，棄上清）加入500µl結合液輕輕重懸細胞。        D、加入5µl Annexin V-FITC，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。      E、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進行避光。F、隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞即可檢測。3、對于貼壁細胞的原位熒光顯微鏡檢測：注：本方法的優點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。A、(選做)如果條件許可，把細胞培養于24孔板、48孔板或96孔板內；或將細胞于蓋玻片上生長，用適當的凋亡誘導劑誘導細胞凋亡，并設立陰性對照組。B、吸除細胞培養液，加入PBS洗滌兩次；或將蓋玻片用PBS洗滌兩次。（選做步驟：用250ul的結合液洗滌蓋玻片一遍）        C、在500μL 的結合液中加入5μL Annexin V-FITC， 5 μL碘化丙啶，輕輕混勻。        D、將上述溶液滴加于培養板孔中，或滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋。        E、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘，隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

保存條件

4℃保存，Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需避光保存，一年有效。為長期保存，可以把Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液適當分裝后-20℃保存，結合液可以直接-20℃保存。

注意事項

1、如果有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。2、染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。同時熒光物質均易發生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。3、如果檢測時Annexin V-FITC的熒光比較弱，建議用250ul的結合液輕輕重懸洗滌細胞，去除殘余的磷酸鹽溶液，同時也可縮小結合液的體積（比如200ul的體積）來提高Annexin V-FITC的工作濃度。4、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。5、本試劑盒適用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不以應低于1×105，，不適用于檢測組織樣本6、因檢測細胞的類型、凋亡誘導劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此建議每次檢測均需使用未經凋亡誘導處理的細胞作為對照，進行熒光補償的調節。7、用流式細胞儀檢測，激發波長Ex=488 nm; 發射波長Em=530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測；PI紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測，建議使用FL3。熒光補償調節：使用未經凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置。