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深圳市安培生物科技有限公司
中級會(huì)員 | 第5年
細(xì)胞死亡的三種方式以及倆種凋亡細(xì)胞的檢測方法(Tunel、Annexin V)2025/04/01
細(xì)胞死亡動(dòng)物細(xì)胞的死亡主要有三種方式:細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死和細(xì)胞自噬。目前對動(dòng)物細(xì)胞凋亡的特征、機(jī)制和生物學(xué)功能的研究較為深入。細(xì)胞凋亡也被稱為程序性細(xì)胞死亡(programmedcellDeath,PCD)。PCD最初是發(fā)育生物學(xué)中提出的概念,其含義是發(fā)育過程中發(fā)生的某類細(xì)胞的大量死亡,而這種細(xì)胞死亡要求特定的基因表達(dá)。細(xì)胞凋亡的典型特征是DNA規(guī)律性斷裂為180-200bp整數(shù)倍的片段,并暴露出3'-OH末端,在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)呈現(xiàn)有規(guī)律的梯狀條帶。細(xì)胞壞死是區(qū)別于細(xì)胞凋亡的另一種典型死亡方式
分子克隆實(shí)驗(yàn)---第三章:測序結(jié)果解讀2025/04/01
一代測序是克隆實(shí)驗(yàn)中常見的下游實(shí)驗(yàn)。現(xiàn)代DNA測序技術(shù)源于Sanger鏈末端終止測序法,其工作原理與Sanger測序不同的是4組反應(yīng)的雙脫氧核苷酸分別用不同的熒光分子標(biāo)記,每個(gè)試管的產(chǎn)物在光激發(fā)下發(fā)出不同顏色的熒光,延伸反應(yīng)和鏈終止完成后,將全部4組反應(yīng)物混合,在同一泳道進(jìn)行凝膠電泳,通過激光束激發(fā)熒光分析不同位置堿基的熒光顏色完成測序分析。一般情況下,測序信號文件多為*.ab1文件,該文件能夠得到每個(gè)堿基的測序峰型及整體質(zhì)量;*.seq文件則為ab1文件導(dǎo)出得到的測序結(jié)果序列,ab1文件中已具
分子克隆實(shí)驗(yàn)的流程及注意事項(xiàng)--四、定點(diǎn)突變2025/03/24
四、定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增1.引物設(shè)計(jì)要求:5’-15-21bp反向互補(bǔ)區(qū)域+至少15bp非互補(bǔ)區(qū)域-3’,反向互補(bǔ)區(qū)域GC含量40%-60%,待突變位點(diǎn)至引物3’端Tm值60°C。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇對應(yīng)模塊進(jìn)行引物設(shè)計(jì);2.建議使用試劑盒搭配的擴(kuò)增模塊進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并摸索退火溫度,優(yōu)化反應(yīng)體系和程序;3.PCR擴(kuò)增體系的模板質(zhì)粒投入量推薦50μl體系投入1ng,擴(kuò)增循環(huán)數(shù)應(yīng)當(dāng)≤35個(gè)。擴(kuò)增產(chǎn)物DpnI消化和純化回收1.取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,判斷是否存在目的大小的
分子克隆實(shí)驗(yàn)的流程及注意事項(xiàng)--三、同源重組2025/03/24
本方法適用于總長度(載體+所有片段)不超過20kb的重組實(shí)驗(yàn)。目的片段引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增1.2.1.引物同源臂設(shè)計(jì)要求:15-20bp(不計(jì)算酶切位點(diǎn)),GC含量40%-60%;根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇對應(yīng)模塊進(jìn)行引物設(shè)計(jì);2.建議使用高保真酶進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增,并摸索退火溫度,優(yōu)化反應(yīng)體系和程序。載體線性化1.雙酶切:同時(shí)選擇兩種限制性內(nèi)切酶對載體質(zhì)粒進(jìn)行線性化處理。內(nèi)切酶選擇可參考第二章第一節(jié)內(nèi)容;2.單酶切:選擇一種限制性內(nèi)切酶對載體質(zhì)粒進(jìn)行線性化處理。內(nèi)切酶選擇可參考第二章第一節(jié)內(nèi)容;3
分子克隆實(shí)驗(yàn)的流程及注意事項(xiàng)--二、TOPO克隆2025/03/19
二、TOPO克隆引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增1.目的片段PCR擴(kuò)增引物合成時(shí),要求引物5’端不可磷酸化修飾;2.建議使用高保真酶進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增,并摸索退火溫度,優(yōu)化反應(yīng)體系和程序。PCR產(chǎn)物的純化回收1.PCR反應(yīng)后,產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,判斷是否存在目的大小的條帶;2.推薦使用切膠回收的方式純化(切膠時(shí)間最好控制在3min內(nèi),避免紫外照射對DNA的損傷),回收濃度使用NanoDrop/OneDrop等儀器檢測,濃度應(yīng)當(dāng)≥30ng/μl,并跑膠鑒定是否僅存在目的條帶;3.回收濃度低時(shí)
分子克隆實(shí)驗(yàn)的流程及注意事項(xiàng)--一、酶切連接2025/03/18
一、酶切連接一般來說,限制性內(nèi)切酶的選擇非常重要。建議從以下方面判斷選擇:1.限制性內(nèi)切酶的識別序列在目的載體中存在且只有一個(gè),在目的片段中不存在;2.盡量選擇酶切產(chǎn)物為粘性末端、酶切效率高的限制性內(nèi)切酶,如BamHI、HindIII等;3.雙酶切時(shí),注意緩沖液對兩種內(nèi)切酶的活性影響,可根據(jù)具體活性相應(yīng)調(diào)整酶量和反應(yīng)時(shí)間;若緩沖液不能同時(shí)滿足兩種酶的要求,需要分步酶切;4.單酶切時(shí),建議對線性化載體進(jìn)行去磷酸化操作,減少載體自身環(huán)化的出現(xiàn)。注:酶切后,為防止載體自連,尤其當(dāng)酶切后產(chǎn)物末端可互補(bǔ)或
分子克隆實(shí)驗(yàn)解決方案-第一章:分子克隆實(shí)驗(yàn)概述2025/03/14
第一章:分子克隆實(shí)驗(yàn)概述分子克隆技術(shù)是目前實(shí)驗(yàn)室常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一,研究者運(yùn)用該技術(shù)能夠?qū)NA片段以體外重組的方式構(gòu)建至載體,研究者運(yùn)用該技術(shù)能夠?qū)NA片段以體外重組的方式構(gòu)建至載體,隨后通過轉(zhuǎn)化操作導(dǎo)入合適的宿主中復(fù)制擴(kuò)增,最后篩選得到滿足實(shí)驗(yàn)需求的載體克隆。一、分子克隆實(shí)驗(yàn)方法分子克隆研究一般需要將特定DNA片段插入至載體形成重組質(zhì)粒。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢⒊R姷姆肿涌寺〖夹g(shù)進(jìn)行分類:·入門克隆:TA克隆、TOPO克隆。·定向克隆:同源重組、酶切連接(黏性末端雙酶切反應(yīng))。·定點(diǎn)突變:堿
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的結(jié)果分析--實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 常用名詞2025/03/10
校正染料(ROX)校正加樣誤差或孔與孔之間的誤差,提供一個(gè)穩(wěn)定的基線,極大地改進(jìn)定量的精確度,提高重復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。注意:不同的儀器對ROX的需求不同。基線PCR的最初幾個(gè)循環(huán),在此基線上熒光信號幾乎沒有變化。閾值可以相信的最小熒光值。CT值擴(kuò)增曲線與閾值交點(diǎn)的橫坐標(biāo)。二、結(jié)果有效性判斷融解曲線單峰(染料法)擴(kuò)增曲線指數(shù)擴(kuò)增區(qū)域,復(fù)孔間CT值STD閾值設(shè)置合理閾值位于指數(shù)增長期:儀器會(huì)自動(dòng)計(jì)算閾值,但并非所有情況下儀器計(jì)算結(jié)果都是合理的,必要時(shí)進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整。NTC確認(rèn)無氣溶膠污染或可以忽略
實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用及結(jié)果分析--相對定量和絕對定量2025/03/07
第三章:實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用一、相對定量測定不同樣品中基因表達(dá)量的相對值。內(nèi)參基因的選擇(1)始終選擇表達(dá)充沛、均一的基因做為內(nèi)參基因;(2)不要盲目選擇常用的內(nèi)參基因;(3)常用內(nèi)參基因:GAPDH,Actin,Tublin。內(nèi)參基因的選擇至關(guān)重要,決定結(jié)果的有效性加入內(nèi)參基因后:結(jié)果計(jì)算二、絕對定量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品,測定樣品中基因表達(dá)量的絕對值(拷貝數(shù))。標(biāo)準(zhǔn)品:具有明確拷貝數(shù)濃度的樣品A/克隆質(zhì)粒B/PCR產(chǎn)物C/cDNA(擴(kuò)增效率測定等用途可以使用,絕對定量不能使用)拷貝數(shù)計(jì)算平均分子量(
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 操作流程及注意事項(xiàng)---FAQ2025/03/04
FAQ總RNA提取-酚氯仿抽提法RNA降解組織樣本保存不當(dāng)。RNA提取時(shí)需選擇新鮮組織或細(xì)胞樣本,若為凍存樣本,盡量避免反復(fù)凍融。樣品離開活體或原來的生長環(huán)境后,樣品中的內(nèi)源RNase開始降解RNA,降解速度與內(nèi)源RNase的含量及溫度有關(guān)。也可將新鮮組織充分浸泡在RNAKeeperTissueStabilizer(Vazyme#R501)中,組織可于室溫存放一周,4℃存放一個(gè)月或-20℃/-80℃長期保存。投入樣本較多,導(dǎo)致裂解不充分。RNA保存時(shí)間過久,發(fā)生降解。對提取的RNA進(jìn)行純度和完整
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 操作流程及注意事項(xiàng)---實(shí)時(shí)熒光定量 PCR2025/03/04
實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作流程概要基于SYBR染料法的qPCR反應(yīng)體系以Vazyme產(chǎn)品ChamQTMUniversalSYBR®qPCRMasterMix(Vazyme#Q711)為例組分自備材料ddH2O、1.5ml離心管、qPCR管冰或移動(dòng)冰盒操作流程(以ABIStepOnePlusTM為測試機(jī)型)基于Taqman探針法的qPCR反應(yīng)體系以Vazyme產(chǎn)品AceQ®UniversalU+ProbeMasterMixV2(Vazyme#Q513)為例組分自備材料ddH2O、1.5ml離心管、qP
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 操作流程及注意事項(xiàng)--逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)2025/02/27
操作流程概要基于后期為qPCR的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系以Vazyme產(chǎn)品HiScript®IIIRTSuperMixforqPCR(+gDNAwiper)(Vazyme#R323)為例自備材料RNase-free1.5ml離心管、0.2mlPCR管冰或移動(dòng)冰盒組分操作流程2.配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系3.進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相關(guān)產(chǎn)品安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)。總部設(shè)在廣東,服務(wù)面向全國
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 操作流程及注意事項(xiàng)--RNA模板的制備2025/02/26
一、RNA模板的制備常見的RNA提取的方法:傳統(tǒng)的酚CHCl?抽提法和柱式抽提法。操作流程概要酚CHCl?抽提法以Vazyme產(chǎn)品RNAisolaterTotalRNAExtractionReagent(Vazyme#R401)為例自備材料CHCl?,異丙醇,75%乙醇(DEPC水配制),DEPC水組分樣本制備(過多的樣本量可能會(huì)導(dǎo)致樣本裂解不充分,并使產(chǎn)物純度降低;)1mlRNAisolater能夠充分裂解的最大樣本量如下:貼壁細(xì)胞(對于貼壁牢固的細(xì)胞可用細(xì)胞刮勺剝離細(xì)胞)1.棄培養(yǎng)液,PBS
實(shí)時(shí)熒光定量PCR總述2025/02/10
第一章:實(shí)時(shí)熒光定量PCR總述一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的概念實(shí)時(shí)熒光定量PCR即Real-timePCR,利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過CT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理A化學(xué)原理變產(chǎn)物DNA分子為熒光信號,通過測定熒光值即可反映產(chǎn)物DNA分子量。B數(shù)學(xué)原理通過循環(huán)數(shù)“n”(CT值)來計(jì)算起始DNA量。三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的選擇四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)勢比較不同樣品間某基因的“量”的方法:實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn):(1)能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測
提取純化產(chǎn)品冊---09 樣本快速裂解(P073)2025/02/08
RoomTempTMSampleLysisKit(P073)室溫裂解試劑盒(P073)--保存條件:2~8℃保存●操作簡捷室溫3min即可,無需復(fù)雜模板提取●裂解效率高裂解試劑與傳統(tǒng)試劑盒提取基因組效果一致。●應(yīng)用廣泛兼容Taqman®探針法的SNP檢測,qPCR探針法定量,PCR擴(kuò)增等;樣本兼容廣:可裂解新鮮血液、凍存血液、常規(guī)抗凝劑血液、組織勻漿、口腔拭子、FTA卡等多種樣本產(chǎn)品概述RoomTempTMSampleLysisKit是一個(gè)簡單快速的血液室溫裂解試劑盒。本試劑盒包含LysisBu
提取純化產(chǎn)品冊---08 外泌體(R603)2025/02/08
VEX®ExosomeIsolationReagent(fromplasma)血漿外泌體提取試劑(R603)●操作簡單快捷無需超高速離心機(jī),一步沉淀●兼容低量樣本起始樣本血漿量可低至500μl●產(chǎn)量穩(wěn)定可靠較低的離心力沉淀,獲得的外泌體結(jié)構(gòu)更完整,較傳統(tǒng)提取方法具有更高產(chǎn)量保存條件:VEXExosomeIsolationReagent(fromplasma)保存于2℃-8℃ProteinaseK保存于-15℃~-30℃產(chǎn)品概述本產(chǎn)品是專門用于分離血漿樣本中外泌體的試劑,只需通過簡單的較低速度離心
提取純化產(chǎn)品冊---08 外泌體(R602)2025/02/06
VEX®ExosomeIsolationReagent(fromserum)血清外泌體提取試劑(R602)---保存條件:保存于2℃-8℃●操作簡單快捷無需超高速離心機(jī),一步沉淀●兼容低量樣本起始樣本血清量可低至500μl●產(chǎn)量穩(wěn)定可靠較低的離心力沉淀,獲得的外泌體結(jié)構(gòu)更完整,較傳統(tǒng)提取方法具有更高產(chǎn)量產(chǎn)品概述本產(chǎn)品是專門用于分離血清樣本中外泌體的試劑,只需通過簡單的較低速度離心即可從樣本中分離出大量外泌體。與傳統(tǒng)的超高速離心相比,樣本中的外泌體所受到的壓力較小,可以保持較完整的形態(tài);同時(shí)提取過
提取純化產(chǎn)品冊---08 外泌體(R601)2025/02/06
VEX®ExosomeIsolationReagent(fromcellculturemedia)細(xì)胞培養(yǎng)液上清外泌體提取試劑(R601)---保存條件:2℃-8℃保存●操作簡單快捷無需超高速離心機(jī),一步沉淀●兼容低量樣本細(xì)胞培養(yǎng)上清可低至1ml●產(chǎn)量穩(wěn)定可靠較低的離心力沉淀,獲得的外泌體結(jié)構(gòu)更完整,較傳統(tǒng)提取方法具有更高產(chǎn)量產(chǎn)品概述VEX®ExosomeIsolationReagent(fromcellculturemedia)是專門用于分離提取細(xì)胞培養(yǎng)液上清樣本中外泌體的試劑,通過簡單的較低
提取純化產(chǎn)品冊---07 產(chǎn)物回收(DC301)2025/01/23
FastPure®GelDNAExtractionMiniKit膠回收/DNA純化試劑盒(DC301)簡單快速只需加入1倍體積溶膠液,無需柱平衡,操作簡單快速,10min-15min即可完成純化工作一盒兩用不僅可用于DNA凝膠回收,也可用于DNA粗品純化回收效率高回收效率可高達(dá)80%回收DNA片段范圍廣適用于70bp-20kb的DNA片段回收保存條件:室溫(15℃-25℃)保存▲若低溫保存,溶液容易產(chǎn)生沉淀。在使用前務(wù)必將試劑盒內(nèi)的溶液在室溫中放置一段時(shí)間,必要時(shí)可在37℃水浴鍋中預(yù)熱10min
提取純化產(chǎn)品冊---06 柱式DNA提取產(chǎn)品(DC202、DC203)2025/01/22
FastPure®EndoFreePlasmidMaxiKit質(zhì)粒大提試劑盒(DC202)內(nèi)毒素含量極低,后續(xù)可做轉(zhuǎn)染級別實(shí)驗(yàn)產(chǎn)量高,高拷貝質(zhì)粒產(chǎn)量達(dá)到0.2mg-1.5mg操作簡便保存條件:試劑盒除RNaseA和內(nèi)毒素清除劑外,其他組分室溫保存;RNaseA保存于-30℃~-15℃;內(nèi)毒素清除劑2℃-8℃可以保存一個(gè)月,長期保存放-30℃~-15℃▲若低溫保存,溶液容易產(chǎn)生沉淀。在使用前務(wù)必將試劑盒內(nèi)的溶液在室溫中放置一段時(shí)間,必要時(shí)可在37℃水浴鍋中預(yù)熱10min,溶解沉淀,混勻后再使用。產(chǎn)
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