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胎牛血清給細胞提供的作用2023/07/24

胎牛血清是細胞培養(yǎng)中常用的添加培養(yǎng)基。它營養(yǎng)豐富，大約含有三四百種不同成分，具有基礎(chǔ)培養(yǎng)基所不具備的營養(yǎng)因子。它給細胞提供的益處主要有六個方面。1、提供細胞生長所需的天然激素或天然的生長因子。2、提供天然的結(jié)合蛋白，能識別氨基酸、脂質(zhì)、金屬離子和激素等，能結(jié)合并調(diào)節(jié)它們的活性。已知清蛋白(albumin）即具有上述功能，并對細胞代謝、生物合成、增殖和存活具有潛在的影響。又如胎牛血清中富含胎球蛋白（Fetuin），具有多個鈣離子結(jié)合位點，因而能調(diào)節(jié)和維持血清中的鈣離子濃度。3、天然含有粘附蛋白等細

大腸桿菌概述及菌株的分型2023/07/17

大腸桿菌作為外源基因表達的宿主,遺傳背景清楚,技術(shù)操作簡單,培養(yǎng)條件簡單,大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟,倍受遺傳工程專家的重視.目前大腸桿菌是應用zui廣泛,最成功的表達體系,常做高效表達的shou選體系。真核基因在大腸桿菌中表達,必須有合適的表達載體(Vector),常用載體:pBV220,pET系統(tǒng)。一、目的基因在大腸桿菌中表達的情況:大腸桿菌更適合原核基因的表達,外源基因表達產(chǎn)量與單位體積產(chǎn)量是正相相關(guān)的,而單位體積產(chǎn)量與細胞濃度和每個細胞平均表達產(chǎn)量呈正相相關(guān).細胞濃度與生長速率,外源基因拷貝數(shù)和表達

單克隆抗體和多克隆抗體從多方面分析區(qū)別2023/07/10

抗體是我們實驗中zui常用到的一種物質(zhì)之一，抗體主要是分為單克隆抗體和多克隆抗體兩大類，本文從定義、制備方式、性質(zhì)特點及應用上的區(qū)別對單抗和多抗進行比較。一、定義上的區(qū)別機體受抗原刺激后，由淋巴系統(tǒng)的細胞(主要是B淋巴細胞分化后的漿細胞)產(chǎn)生具有特異性免疫功能球蛋白，即抗體。抗原物質(zhì)上能刺激B淋巴細胞的結(jié)構(gòu)部位叫做抗原決定簇，一個抗原具備多個抗原決定簇，只針對一個抗原決定簇起作用的漿細胞群就是一個純系，即一種克隆，由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。機體受到抗原的刺激往往會針對抗原的多個抗

ELISA方法的測定內(nèi)容闡明2023/07/03

ELISA方法測定內(nèi)容包括酶和抗體活性、結(jié)合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結(jié)合率。1、酶與抗體的活性常用瓊脂擴散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現(xiàn)應有的顏色反應，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結(jié)合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后，瓊擴滴度應在1:16以上。另一個測定方法是用系列稀釋的酶標抗體直接以ELISA方法進行方陣滴定，此法不僅可以測定標記效果，還可以確定酶標抗體的使

ELISA顯色及結(jié)果判斷2023/06/26

試劑顯色時A、B液按順序加入且間隔不超過10min，如先將兩液混合再加樣則需保證等體積混合。顯色劑不宜過多，注意避光反應。顯色是最后一步溫育反應，酶將無色底物催化反應呈有色，反應的溫度和時間均為影響結(jié)果的重要因素，目前市場上大多數(shù)進口的ELISA檢測顯色溫度處于18~30℃。一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，但陽性孔會隨時間的延長而顯色加強。研究表明，顯色溫度對實驗結(jié)果有明顯影響，顯色溫度不同，試劑最di檢測能力差距非常大，溫度低于21℃時試劑盒對于質(zhì)控物的檢出能力下降，溫度過低導致結(jié)合反應速率變慢

抗體特異性選擇著重參考方方面2023/06/05

抗體(antibody)免疫細胞分泌免疫物質(zhì)，是哺乳動物適應性免疫系統(tǒng)對抗病原體的核心，它是在病原體刺激下由漿細胞（效應B細胞）所分泌的一種免疫球蛋白，能夠識別并結(jié)合特異的病原體抗原，隨后通過介導中和作用、調(diào)理作用、效應T細胞殺傷等來清除病原體。隨著抗體制備與改造技術(shù)的飛速發(fā)展，抗體已經(jīng)廣泛應用于生命科學各個領(lǐng)域，包括科學研究、診斷、治療等。特異性（specificity）的本質(zhì)含義是“Connectedwithoneparticularthingonly"即只與唯yi的特定事物相關(guān)，具有專一性

ELISA試驗洗板與沖洗技術(shù)注意要點2023/05/29

ELISA試驗過程中正確的洗滌和沖洗方案尤其重要。在下游分析過程中，不充分、不一致和/或過度清洗會造成問題。有許多洗板的方法，包括使用自動洗板機、手動分流器或洗瓶。當手動吸出孔中的液體時，要注意不要碰到孔的底部--吸管的尖duan應該放在孔的一側(cè)。為了減少背景信號，清洗量需要足夠大，以去除孔中未結(jié)合的樣品和試劑。然而，過度洗滌會減少目標信號。確保所有的孔都被平均清洗，以避免在整個檢測板上引入信號變化。要做到這一點，如果是手工清洗，請檢查移液器吸頭是否固定好，如果使用自動洗板機，所有分配和吸液的噴

化學試劑各種類總述2023/05/24

所謂化學試劑：就是化學實驗所用的藥劑；即化學實驗需要的化學藥劑。化學品純度、級別的劃分，可以根據(jù)化學藥劑的質(zhì)量標準和適用范圍來去確定。據(jù)此，化學試劑1級劃分為標準試劑、生化試劑、電子試劑、實驗試劑四個大類。1級標準的分類原則不但明確了質(zhì)量標準，而且兼顧了該化學試劑的適用范圍。2級標準是在1級分類基礎(chǔ)上更進一步的劃分，它是1級標準的進一步明確和限定。3級標準主要是為了與原來舊標準的對照，或者指明更加準確確定的用途。在1級或2級確定后，一個化學試劑的質(zhì)量指標，和此質(zhì)量指標所能夠適用的應用目的也就確定

PCR設(shè)計引物需考慮問題匯總2023/05/15

在整個PCR體系中，引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能與引物進行有效的延伸，可見引物設(shè)計好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。PCR設(shè)計引物需考慮問題匯總：1．酶切位點兩個酶切位點應是載體上的，所連接片斷上沒有這兩個位點，且距離不能太近，否則往往導致兩個酶都切不好。因此，兩個酶切位點要緊挨在一起，只能切一個，除非恰好是與上面兩個酶在一起的酶切位點，最好隔四個核苷酸。且不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAAG，這樣的

血清應用使用指南2023/05/05

細胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是zui常用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價格昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清，如廠家能做到這一點，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種。血清的質(zhì)量，種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長，而不同批次的血清支持細胞生長的能力也不同，尤其是對克隆細胞的生長，某些

有關(guān)ELISA包被方式分析2023/04/23

1、包被的條件包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據(jù)試驗的特點和材料的性質(zhì)而選定。抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的zui適當濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug

RT-PCR反應體系詳解2023/04/20

PCR反應需要以雙鏈DNA作為模板，因此最初的PCR反應用于檢測目標樣本的基因組中是否存在特定的目的片段，但是這種以基因組DNA為模板的PCR反應無法檢測目的基因是否在樣本中表達，此外由于真核生物的基因中存在內(nèi)含子，直接通過基因組DNA進行PCR也很難確定樣本中是否存在目的基因，針對這一問題，發(fā)展出了逆轉(zhuǎn)錄PCR的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)原理：逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，之后再進行PCR的過程。mRN

提高ELISA實驗檢測的特異性操作注意事項2023/04/10

提高ELISA實驗檢測的特異性操作注意事項：1、加樣對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋，如果加樣不準就會造成誤差，尤其當稀釋倍數(shù)大時，很小的誤差，會導致較大的相對誤差，使陰性（或弱陽性）標本呈陽性（或陰性）。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統(tǒng)處理標本，可較好地避免以上誤差。2、洗滌在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結(jié)果的關(guān)健一步，應引起操作者重視。無論是手工操作還是機器操作，得出不正確的結(jié)

原代細胞的培養(yǎng)基本條件2023/03/20

原代細胞培養(yǎng)是將機體內(nèi)的某組織取出，分散成單細胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖、細胞的接觸抑制、以及細胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。原代細胞的培養(yǎng)條件：一、靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養(yǎng))培養(yǎng)1、細胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性；2、細胞接種時濃度要稍大一些，至少為5×108細胞/L；3、培養(yǎng)基可用Eagle(MEMCorning10-010-CVR)或DMEM(Corning10-013-CVR)培養(yǎng)；4、胎牛血清濃度為10%-8

有關(guān)?PCR反應原理詳解2023/03/13

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以

ELISA試劑盒實驗中常用的樣本制備參考2023/03/06

血清和血漿是elisa試劑盒實驗中常用的樣本類型,那么制備方法可參考以下.1、血清（serum）的一般制備方法可參考以下：1）、采集血液樣本，置于不含抗凝劑的收集管內(nèi)（試管或離心管）2）、室溫下靜置自然凝集30~60min，待血液凝固3）、沿收集管壁將血凝塊輕輕劃開4）、4℃放置過夜，平衡后，低溫低速離心10min（低溫：4℃；低速：人血~2000rpm、小鼠~1000rpm、大鼠~2500rpm）5）、上清即為血清，大概1ml血液能收集300-400ul血清6）、立即操作、冷藏或冷凍血清樣品2

ELISA試劑盒實驗操作的影響2023/02/28

ELISA測定中影響因素較多，操作過程中每個環(huán)節(jié)都會對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響，出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。以下是ELISA試驗操作中的影響因素：1、加樣孵育前加樣時間過長，酶試劑加出孔外，使用滴瓶滴加試劑時，滴加的角度不同和擠壓的力度不同，致使滴加的試劑量不準，都可導致試驗結(jié)果不準確。控制方法：①實驗樣本過多時，可分批次操作，以減少實驗時間延長造成的誤差；②加酶試劑后，用吸水紙吸干孔外試劑；③作定量試驗時，使用加樣器加注試劑，并經(jīng)常校正其準確性，此外，要做到一份樣本一個移液頭，防止交叉污染。2、溫育溫育是ELIS

探討PCR檢測試劑盒溫度循環(huán)參數(shù)2023/02/20

探討PCR檢測試劑盒溫度循環(huán)參數(shù)：1．變性溫度與時間PCR反應中模板DNA的變性十分重要。只有wan全性的模板DNA和PCR產(chǎn)物雙鏈wan全解開，才能有效的和引物結(jié)合。這種結(jié)合是PCR擴增的基礎(chǔ)。變性溫度越高，時間越長變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響TaqDNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應中第一個循環(huán)變性最重要，需時間較長，因模板DNA的鏈比較長。2．復性溫度與時間變性溫度是PCR反應成敗的關(guān)鍵，復性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復性越好，但是

ELISA試劑盒檢查中顯色液A和B效果分析2023/02/15

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enaymelikedimmunosorbent,ELISA)是20世紀70年代發(fā)展起來的一種檢查技能,因其具有靈敏性高、特異性強、操作簡略等長處,被廣泛運用于各種抗原和抗體的測定。ELISA試劑盒檢查中顯色液A和B效果分解如下：酶聯(lián)免疫確診試劑盒的底物A即是顯色劑A（含過氧化氫）為供氫體（DH2）,底物B即是顯色劑B（含TMB）,用于顯色。別的，常用的底物還有：AP的底物，常用的為對-硝基苯磷酸脂（PNP），其反響物為黃色的對硝基酚，測讀波長為405nm2）GOD的底物，為葡

追蹤PCR實驗中污染源2023/02/10

如果不慎發(fā)生污染情況，應從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。1.設(shè)立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應選擇擴增弱，且重復性好的樣品，因強陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對照，100個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR敏感性ji高，可以從其它方法（Sourthern印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應包括PCR體系中各試劑的時機對照，即包括