核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現(xiàn)時(shí)，可使DNA附在細(xì)胞表面，利于細(xì)胞吞入攝取，或通過(guò)細(xì)胞膜脂相收縮時(shí)裂開(kāi)的空隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞的DNA僅有1%～5%可以進(jìn)入細(xì)胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細(xì)胞DNA整合，在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4，這項(xiàng)技術(shù)能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)或長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化的研究。此方法對(duì)于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染是zui常用并的方法。 

1、配液 

(1)2×HBS 1.63g NaCl 

1.19g Hepes 

0.023g Na2PO4、2H2O 

加水至100ml pH7.1過(guò)濾，4℃保存 

(2)2mmol/L CaCl2 過(guò)濾除菌 

(3)TE：0.1mmol/L EDTA 

1mmol/L Tris-HCL PH8.0 

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL過(guò)濾除菌4℃保存。

(5)G418選擇培養(yǎng)基：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制G418，G418濃度為200～ 800mg/L 

注意：對(duì)受體細(xì)胞先做預(yù)試驗(yàn)，選用濃度為在10～14天內(nèi)能殺死細(xì)胞50%以上的zui低濃度。 

2、操作步驟[方法一]： 

(1)供體DNA制備：方法按前介紹的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。 

(2)受體細(xì)胞的培養(yǎng)：研究癌基因轉(zhuǎn)移應(yīng)選擇不含人類(lèi)Alu序列的動(dòng)物細(xì)胞系作為受體細(xì)胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細(xì)胞系等，該細(xì)胞有一定自發(fā)轉(zhuǎn)化傾向，一般在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞，接種密度為2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞占50～70%瓶底面積時(shí)，用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。 

(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備 

①將供體細(xì)胞DNA和PSV2-neo質(zhì)粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時(shí)向供體細(xì)胞DNA液.200μl中加入帶基因neo質(zhì)粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo為1～2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混勻30秒。 

③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。 

(4)轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 

①將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期已占瓶底50～70%的受體細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)更換一次新鮮培養(yǎng)基，每瓶5ml（25ml培養(yǎng)瓶）。 

②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養(yǎng)液的細(xì)胞瓶中搖勻。 

③置37℃ 5% CO2培養(yǎng)24h或更長(zhǎng)，使細(xì)胞充分吸入DNA-磷酸鈣結(jié)晶顆粒。 

④更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。 

⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。同時(shí)設(shè)有未能轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞。 

⑥培養(yǎng)大約3～5天，對(duì)照細(xì)胞大部分死亡，這時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基，每3～4天更換一次選擇培養(yǎng)基。 

⑦2周后對(duì)照細(xì)胞死亡，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瓶中可見(jiàn)有抗藥性的細(xì)胞克隆出現(xiàn)，待其增大后再進(jìn)行克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)，可建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株，并做進(jìn)一步鑒定。