色譜柱的分離度與色譜柱的長度、固定相的性質、液膜厚度、載氣流速和性質、柱溫均有關系。

1分離度R與柱長L的平方根成正比，因此，采用較長的色譜柱可以獲得更高的分離度，但相應的分析時間也會延長。而且色譜柱越長壓降越大，柱過長會增大進出口壓力比，相反會降低分離度。

2固定相的性質與分析物越相似，分離度就越高。

3從上述公式可以看出，液膜厚度的增加會導致塔板高度的增加，柱理論塔板數降低，同時還會增加分析物在固定相中的分配系數，理應導致分離度的降低，但事實上，在分配系數增加的同時，△K增加更為顯著，所以液膜厚度的增加能提高分離度。

4分子質量大的載氣的優點是擴散作用小，缺點是在柱中壓降大、流速慢，即分析周期長。分子量小的載氣傳質阻力小，有利于提高色譜分析速度，但是濃度較高的介質易在其間形成擴散，影響分離度，所以在實際測量中氫氣、氦氣一般都用于介質濃度較低的區域并提高其流速，減少擴散的影響。

5色譜柱存在一個*載氣流速，但實際分析中為了縮短分析時間，流速通常稍大于*流速。

6提高柱溫能提高分析物在流動相和固定相中的擴散系數，降低傳質阻力，加快分析速度，同時使得色譜峰變窄、變高，但會導致分離度的下降。

7色譜分離是樣品在流動相和固定相中反復分配的過程，過載后本來該進入固定相的樣品在固定相在得不到保留，就被流動相推著往前走，因此造成了保留變化，因此進樣量與分離度也是有關系的。