應用半制備液相色譜分離制備高純度苜蓿素

竹茹Bambusae Caulisin Taenias作為藥食兩用的藥材，在《中藥辭海》中記載為禾本科剛竹屬、箣竹屬和牡竹屬中一些竹種的莖稈所刮下的外皮層或其次一層，具有清熱化痰、除煩止嘔等功效，常用于治療熱痰引起的痰熱咳嗽、痰火挾痰、煩熱嘔吐等病癥，在《神農本草經》中列為中品，《藥品化義》曰：“竹茹輕可去實，涼能去熱，苦能降下，專清痰，為寧神開郁佳品”，是臨床*的常用藥，收載于《中國藥典》2010年版。

苜蓿素（tricin），又稱麥黃酮、小麥黃素，化學名稱為5, 7, 4′-三羥基-3′, 5′-二甲氧基黃酮。苜蓿素在苜蓿[3]、大麥[4]、竹葉[5]、地膽草[6]、軟蒺藜[7]、野菊花[8]等植物中多有檢出。Hudson等[9]的研究表明苜蓿素能有效抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-468和人結腸癌細胞SW480的生長。Cai等[10]進一步研究了苜蓿素對MDA-MB-468細胞株的體外生長抑制及其細胞周期抑制作用。然而，除了癌癥防護之外，已知關于苜蓿素藥理活性研究的報道不多，部分原因在于獲得苜蓿素單體較困難。目前，苜蓿素單體主要來源于化學合成，從天然植物中分離制備較大量的苜蓿素的相關報道很少，市場上更無苜蓿素對照品出售。本實驗采用常規色譜和半制備液相色譜結合的方法制備苜蓿素對照品。該法簡便易行，所制備的對照品質量分數可達98%以上。

2  方法與結果

2.1  原料處理竹茹5.5 kg，粉碎至10～20目，采用50%乙醇熱回流提取1.5 h，提取兩次，合并提取液，減壓濃縮成膏狀，得膏狀物145 g，取50 g上40～60目已處理完畢的聚酰胺樹脂，依次采用3倍柱體積10%、30%、50%、70%、95%乙醇洗脫，分別收集樣品、濃縮和凍干，經液相色譜檢測發現70%乙醇洗脫物制備苜蓿素對照品。

2.2  色譜條件

2.2.1  分析色譜條件

色譜柱為Luna C18ODS（250 mm×4.6 mm，5 µm），流動相為乙腈（A）-1%乙酸水溶液（B），梯度洗脫條件：0～15 min，15% A；15～25 min，15%～40% A；25～34 min，40% A；34～40 min，40%～15% A；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫40 ℃；檢測波長345 nm。

2.2.2  半制備色譜條件 

色譜柱為Luna C18ODS（250 mm×10 mm，10 µm），流動相為乙腈-1%甲酸水溶液（35∶65）；體積流量4 mL/min；進樣量1 mL；檢測波長345 nm。2.3  苜蓿素對照品的制備將70%乙醇洗脫物溶解于甲醇中，制成10 mg/mL的樣品，經濾膜（0.45 µm）濾過后備用，半制備型HPLC分離制備，收集保留時間為18.5～19.5 min的組分（圖1），將其減壓濃縮干燥（60 ℃以下），zui后冷凍干燥得到淡黃色粉末170 mg，經峰面積歸一法計算，制備所得的對照品質量分數為98.1%，竹茹中含苜蓿素69.60 μg/g，得率約為44.10%，苜蓿素對照品的HPLC圖譜見圖2。

1. 討論

在進行液相半制備色譜制備前，先將提取物通過聚酰胺柱色譜預處理，在采用10%、30%、50%乙醇洗脫以后，去除了提取物中大量的雜質和一些極性較大的黃酮和酚酸類化合物，使極性較低的苜蓿素得到了進一步的富集。分析色譜發現苜蓿素在30 min左右出峰，乙腈體積分數在40%，為 了盡量減少目標峰與前后雜質峰重疊的可能性，并兼顧單次實驗時間和試劑使用量，因此采用了35%乙腈等度洗脫，既能達到目標峰與雜質峰的極限分離，又能盡可能地節約時間和試劑。選用甲醇-水系統，苜蓿素保留時間過長，且分離效果不佳；選用乙腈-水系統，有主峰與雜質峰重疊現象出現，并伴有拖尾現象發生，因此選用乙腈-酸水系統。前期實驗發現，使用乙酸時，苜蓿素有較好的分離效果，甲酸稍差，因此在分析測試時采用乙腈-1%乙酸水溶液作為流動相；但乙酸沸點較高，不易蒸發，會引起產品純度降低，因此在制備過程中選用乙腈-1%甲酸水溶液作為流動相，甲酸沸點與水相近，易與水一起蒸出，不會引起產品純度降低。單純的柱色譜分離得到的粗品含有多種微量雜質，純度達不到對照品的要求。而通過其他方法純化比較繁瑣，通過液相半制備色譜多個紫外波長的檢測，方法操作方便，可使苜蓿素峰和雜質峰分開，進而使得對照品質量分數達到98%以上。張銳等[15]結合硅膠柱色譜和制備HPLC法對竹根醋酸乙酯部位進行分離純化，得到了質量分數大于98%苜蓿素對照品，方法相對簡便，制備成本較低，*的不足就是硅膠柱色譜洗脫時，需要使用較大量的有機洗脫試劑。而本實驗建立的制備苜蓿素對照品的方法，采用聚酰胺樹脂吸附解析，不同體積分數的乙醇作為洗脫試劑，不僅操作方便，重現性好，而且制備的產品純度高，可用于分析用的對照品，而且避免了有機試劑的大量使用。