IgG的簡易快速提取法(DEAE-纖維素直接提取法和DEAE-SephadexA-50提純法)
應用硫酸銨鹽析及DEAE-纖維素層析法提純化的IgG,不僅操作復雜、需時較長,處理過程中樣品體積大大增加,而且透析時變性嚴重,容易引起抗體效價降低等。為了克服這一不足,特別是當大量提取IgG時,則往往采取下列的簡易辦法。
一、DEAE-纖維素直接提取法
取樣品直接過DEAE-纖維素柱。下面介紹的是zui為簡單的燒杯法。
1、以一定數量的DEAE52放入燒杯中,加入0.01Mol/L pH8.0PB緩沖液,靜置30min,去上清細粒,再重復一次。
2、用布氏漏斗(內放兩層濾紙)過濾。
3、以5g濕重的DEAE-纖維素加1ml血清及3ml蒸餾水混合液的比例,加入各成分,充分攪拌。
4、于4℃中放置1h,中間攪拌數次。
5、用布氏漏斗抽濾,再用0.01Mol/L pH8.0PB緩沖液沖洗纖維素,抽濾。濾液即為提取的IgG液。
二、DEAE-SephadexA-50提純法
DEAE-SephadexA-50為弱堿性陰離子交換劑,經NaOH將Cl-型轉變為OH-型后,可吸附酸性蛋白,血清中除γ-G屬中性蛋白外其余均屬酸性蛋白。當溶液的pH在6.5時,酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附,只有γ-G留在溶液中。因此利用這一原理可以提取 γ-G。這種提取法流程大大縮短,純化前后樣品體積變化不大,而且所得γ-G無變性現象。經過四次處理,其純度也較好。缺點是收集量少,損耗大。
1、DEAE—SephadexA—50的處理。取DEAE-SephadexA-50若干克,懸浮于蒸餾水中,1h后傾去上層小顆粒,然后用 0.50Mol/L NaOH處理1h,蒸餾水洗至中性,再用0.5 Mol/L HCl處理0.5h,水洗至中性,zui后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。
2、取一定的血清量,加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液,再加液體體積1/4的濾干的DEAE-SephadexA-50,混合、4℃放置1h,不時攪拌、抽濾、收集濾液。
3、再用同樣重量的DEAE-SephadexA-50處理濾液。反復處理三次。(全程共四次)。獲得濾液即為γ-G制品。
4、DEAE-SephadexA-50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脫,抽濾至濾液中無蛋白(OD280﹤0.04)后,再用蒸餾水洗至中性即可回收使用。
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