國立中國臺灣大學 生化科技學系 生化研究室 莊榮輝

基礎免疫學：

A）脊椎動物體內有催毀外來入侵物體的免疫系統：

免疫反應可分成先天及后天兩大系統，又各有兩種方式，分別以細胞或分子去掃除入侵物。 當入侵物太多時，即由先天免疫系統誘發后天免疫，開啟了更有效率、更為強大的防御機制。

干擾素： 遭病毒攻擊的細胞會放出干擾素，干擾素會活化免疫系統。

溶菌： 在體表及淚液中溶解細菌細胞壁。

巨噬細胞： zui基層的免疫細胞，是免疫系統的*線防御。

自然殺手細胞： 可清除體內的癌細胞，是免疫監視系統。

B）后天免疫反應的四個階段：

遭遇： 巨噬細胞把抗原分解成小片段，專一地表現給T_H細胞。

動員： T_H細胞動員T_K細胞及B細胞，后者生產專一性抗體。

掃蕩： 抗體及T_K細胞攻擊入侵的抗原。

休止： 完成清除抗原后，免疫細胞休息。

C）后天免疫反應的兩大特點：

專一性： 由 甲抗原 所誘導的免疫反應只對 甲抗原 有效。

記憶性： *后若 甲抗原 再度入侵，可迅速動員掃蕩之。

D）抗體是由B細胞所分泌的蛋白質：

抗體分子： 由四條蛋白質長短煉所組成 （兩重兩輕）。

結 合 區： 抗體分子上有兩個抗原結合區 （二者相同）。

專 一 性： 抗體與抗原結合 專一性 （如lock & key般吻合）。

抗體種類： IgG是單一抗體分子，另有IgM （五元體） 及IgA （二元體）。

為何要使用單株抗體： 

1） 抗原分子上可以誘導出抗體的部位或片段，特稱之為 抗原決定基 （antigenic determinant）；一個抗原分子上通常都有許多處抗原決定基，而每個決定基至少都可誘生出一種抗體；因此在傳統抗血清中，都含有許多種不同的抗體，分別對抗這些不同的決定基。

2） 對于分子構造相似的抗原，由于它們含有共同或相似的抗原決定基，所產生的抗血清對這兩種相似的抗原都會產生反應；因此在檢定此類抗原時，其 專一性 不很理想，常常會出現假陽性，也稱為 交叉反應性。 同時又由于免疫動物的個別體質不同，對抗原的反應也有相當的差異，以致無法準確控制所得到每批抗血清 效價 的高低。

3） 血清中的每一種抗體是由單一個B細胞所分泌產生，若能把此B細胞由脾臟中挑出來，單獨培養成細胞株，則可得單一種類的抗體，只會對一種 抗原決定基 反應，其專一性*。 大量培養此細胞株，即可有質量一定、純度均一的抗體，此即為 單株抗體。

4） 然而B細胞不易在培養基中生長，雖然有人一直努力，想找出在體外培養脾臟細胞的條件，但結果均不甚理想，因此上述想法不易達成。 

5） 癌細胞的生長不受控制，很容易在培養基中生長，有很多已經建立好的癌細胞株，其生長特性均已了解； 若把癌細胞永續生長的特性，利用細胞融合法導入可生產有用抗體的B細胞中，則得到可在培養基中*生長的B細胞株，此即 融合瘤 細胞株。 

6） 廣義來說，細胞融合也可說是 基因重組 的一種，它是以融合兩種不同遺傳特性的細胞，來達成改變遺傳形質的目的。 另外，微生物或植物的細胞，亦可以 原生質體 的形式互相融合，以改變其遺傳性質。

細胞融合法： 實際操作流程請參考 水稻蔗糖合成脢之研究

利用polyethylene glycol （PEG） 進行小白鼠 脾臟細胞 與 骨髓癌細胞 融合，經過 篩選 及 單株化 后，可得到分泌有單株抗體的融合瘤細胞。

A）小白鼠免疫及脾臟細胞：

小白鼠 （BALB/c） 先以目標抗原 （如菌體） 免疫，抗原需加 佐劑 （adjuvant） 制成乳劑，打入小鼠體內慢慢釋出，誘使B細胞成熟增殖并生產抗體，然后取出脾細胞 （大多為B細胞） 與骨髓癌細胞進行細胞融合。近來有人直接取出健康的脾細胞，在試管中加入抗原進行體外免疫；或打開腹腔直接在脾臟注射抗原免疫。 但除非抗原來源困難或有其它目的，一般仍實行舊法，因免疫反應的啟動機制非常復雜，不單是靠脾臟而已。

B）骨髓癌細胞 （NS-1）：

NS-1是穩定的小白鼠BALB/c癌細胞株，除了能在培養基中永續生長外，尚有一重要特性，其細胞缺乏兩種核酸代謝的重要酵素 （TK, thymidine kinase及HGPRT, hypoxanthine-guanine phospho ribosyltransferase）。一般細胞內的核酸合成路徑有兩條，如下圖 （1） 及 （2） 所示：

核酸的 正常代謝途徑 （1） 若被aminopterin阻礙，可由 （2） 救急途徑 （salvage pathway） 取用thymidine及hypoxanthine來合成DNA。 但NS-1缺乏TK及HGPRT兩種酵素，因此在aminopterin存在下，NS-1無法生長；正常細胞 （如B細胞） 則可經由 （2） 救急途徑 繼續生長。 HAT培養基因含有aminopterin, thymidine及hypoxanthine，NS-1在HAT中無法生長，除非經由細胞融合導入TK及HGPRT兩酵素的基因 （可由正常脾臟細胞得來）。
C）細胞融合：

小白鼠脾臟細胞⊕與NS-1細胞⊙以PEG進行融合，操作在10 min內完成，隨即把細胞平均分配在96槽細胞培養盤中。由于融合是隨機的，故可能的組合有：⊕-⊙, ⊕-⊕, ⊙-⊙, ⊕-⊕-⊕, ⊕-⊕-⊙....；只有同時含有⊕與⊙的融合細胞才會活下去：

1）   若只含NS-1 （⊙, ⊙-⊙.....），則在HAT中會因DNA合成抑制而死亡。

2）   若只含脾細胞 （⊕, ⊕-⊕, ⊕-⊕-⊕......），則在體外培養會漸漸死去。

3）   可能活下去的細胞 （⊕-⊙, ⊕-⊕-⊙, ⊙-⊙-⊕.....） 含有來自兩方的染色體，同源染色體可能發生基因重組，互換遺傳訊息；接下去的細胞分裂會排除多余的染色體，一直到只剩一組染色體時才告穩定。在初期的分裂增殖過程中，失去含有重要基因染色體的子細胞可能會死去。成功穩定的融合細胞株會經由染色體的重組，得兼有雙方的特性： 即可分泌抗體，亦可在培養基HAT中生長下去。

D）篩選方法：

1）   初步篩選： 融合后馬上以HAT培養，能活下來的都是上述B細胞與NS-1的正確融合細胞，但此時細胞的遺傳背景尚未穩定。

2）   篩選專一性抗體： 并非所有B細胞都會產生我們所要的抗體，小白鼠原先就存在許多B細胞株以對抗一般疾病； 因此要用 酵素免疫分析法 （ELISA） 挑出專一性抗體 （請見下圖）。

3）   單株化： 這樣所挑出來的細胞株，也許仍含有兩群以上的細胞 （為什么？），因此要進行單株化；先將該細胞株稀釋，重新平分到96槽細胞培養盤中，以計算使得每槽中只含有一個細胞，俟其生長成群落后，再次以ELISA篩選專一性抗體。

E）抗體生產：

1）   可把挑選出來的融合細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然后收集所產生的 腹水，腹水中的抗體濃度非常高，每mL可達數mg。 

2）   把融合細胞在大型培養槽中培養，收集培養液上清即得抗體，但每mL只得約數 mg，濃度較腹水稀約一千倍。

3）   所得到的抗體再經純化步驟，以除去雜質，可用下列各種方法的組合︰

硫酸銨分劃： 收集約40% 飽和度的沉淀，是、方便的方法。     

離子交換法： 用DEAE陰離子交換法，多用在純化IgG。  

膠體過濾法： 以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化IgM。

親和層析法： 以Protein A-吸著劑 專一性地吸住抗體分子 （IgG）。

當單株抗體剛被發展出來時，人們因為它像巡弋飛彈般的準確性，而對其應用于癌癥的治療方面抱以*的希望；但是二十年來，并無突破性的進展。主要的原因，并不是單株抗體無法攻擊癌細胞，或者是單株抗體的專一性不夠；原因之一乃是癌細胞的變化實在太大，無法找出各種癌細胞的共同抗原，以制成通用的抗癌單株抗體。雖然如此，單株抗體并沒有失去其科學上或醫療上的價值，它仍然是一個有用的工具，可以辨認分子上細微的差異，而被應用在很多其他方面；是目前的生物技術產業上，極重要且獲利率高的科技。