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| ELISA檢測試劑盒操作說明書 簡介： 丙酮酸激酶PK是糖酵解途徑的一個關(guān)鍵酶，目前研究表明，幾乎所有不同組織來源的腫瘤均伴有丙酮酸激酶的異構(gòu)重整體M2-PK的過度表達, 故稱為腫瘤型M2-PK（Tumor M2-PK，Tu M2-PK）。在正常細胞中，M2-PK主要以三聚體的形式存在，而在腫瘤細胞中，M2-PK大量表達并轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕远垠w的形式存在。三聚體的M2-PK與磷酸烯醇丙酮酸PEP親和力很高，而二聚體的M2-PK與PEP的親和力則低的多，后者因此導(dǎo)致磷酸烯醇類物質(zhì)的堆積，這有利于腫瘤細胞進行無氧糖酵解。 Tu M2-PK的升高可見于大多數(shù)癌癥患者。盡管不同組織來源的腫瘤或同種腫瘤的不同階段，其血中M2-PK的平均水平存在著一定的差別，但作為腫瘤標志物，M2-PK是很有應(yīng)用價值的。尤其是腎癌，長期以來一直未發(fā)現(xiàn)較特異的腫瘤標志物,M2-PK很可能成為目前*可用于臨床診斷腎癌的生化指標。早在1993年，在Hamburg召開的（德國）第七界腫瘤標志物研討會上，Tu M2-PK就作為一種新的腫瘤標志物被提了出來。不過，比較其特異性而言，Tu M2-PK的靈敏度相對偏低。所以，用于診斷和篩選腫瘤患者，Tu M2-PK還應(yīng)與其他有關(guān)的腫瘤標志物聯(lián)合檢測，以同時提高臨床診斷的特異性和靈敏度。 本試劑盒能靈敏的高特異性地檢測出人體血液內(nèi)的Tu M2-PK------一種可以用于癌癥的篩查、診斷和跟蹤治療的新的腫瘤標記物。 檢測原理： 本實驗采用雙抗體夾心法原理，抗人M2-PK單抗包被于酶標板上，標準品和EDTA血漿標本中的M2-PK就會與板上的單抗結(jié)合，被固定，通過洗板，將未結(jié)合的游離成分洗去；再加入生物素化的M2-PK的抗體和辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素和親合素特異性結(jié)合；抗人M2-PK抗體與結(jié)合在單抗上的M2-PK結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色劑，若反應(yīng)孔中有M2-PK，辣根 1 過氧化物酶會使無色的顯色劑顯藍色，加終止液變黃，在450nm處測OD值，M2-PK濃度與所測OD450值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中M2-PK濃度。 試劑盒組成： 包被有腫瘤M2-PK單克隆抗體的酶標板（12ⅹ8孔） 腫瘤M2-PK標準品1→4個 4×1.0 ml 質(zhì)控液 1×1.0 ml 腫瘤M2-PK多抗 1×10 ml 酶聯(lián)物 2×6.0 ml 濃縮洗滌液（25ⅹ） 1×20 ml 底物A 1×6.0ml 濃縮標本稀釋液（10×） 1×10 ml 底物B 1×6.0ml 終止液 1×6.0ml 標本的收集： 血漿抗凝劑只能使用EDTA，其他血漿均不能使用。建議1-2小時內(nèi)離心，避免劇烈搖動。（2000g離心十分鐘）。標本在40C可以保存一天，在-200C可以保存一年。標本收集后若不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融。 本試劑盒未提供的其它必需品： 1． 500ml的量筒; 2 ml、5 ml、10 ml的吸管; 酶標儀（450+10nm）一臺 2． 微量加樣器：0-50μl，50-200μl，200-1000μl 實驗步驟： 可行的加樣板設(shè)計:
S1~S42：EDTA血漿標本 Blank：吸入100微升標本洗滌液在A1和A2孔 2 STD： 標準品 PC： 質(zhì)控液 標準品：在*條和第二條孔中各加入100微升標準品，作為對照實驗 1號標準品=8U/ml 2號標準品=15U/ml 3號標準品=35U/ml 4號標準品=50U/ml 1. 標準品和質(zhì)控液的準備：向盛有標準品和質(zhì)控液的小瓶中各加入500μl標本稀釋液，并充分混勻。 2. 質(zhì)控液： 20U/ml±10% 在F1和F2孔中各加100μl。 3. 標本洗滌液的準備： 20ml濃縮洗滌液（25ⅹ）+400ml蒸餾水，此份稀釋液在4-80C可保存六周。 4. 標本稀釋液的準備： 用蒸餾水按1：10稀釋，稀釋后放2-8℃保存。 5. 酶標板的準備： 在打開之前把酶標板置于室溫，取需要量的酶標板置于框架內(nèi)，未使用的酶標板于有干燥劑的密封塑料袋中保存。 6. EDTA血漿的稀釋（1：100）: 10μl EDTA血漿+1ml標本稀釋液，充分混合。 7. 按照待測標本數(shù)目取相應(yīng)的酶標板條于框架上，除空白孔外，分別將標本和不同濃度的標準品、質(zhì)控液（100μl/孔）加入相應(yīng)孔中（做雙孔），振蕩均勻，于370C，溫育60min。 8. 取出反應(yīng)的酶標板條，倒掉孔內(nèi)的液體，加入標本洗滌液洗滌5次，于干凈的紙上拍干，除去殘留的液體，向每孔中加入M2-PK多抗100μl，振蕩均勻，于370C，溫育30min。 9. 取出反應(yīng)的酶標板條，倒掉孔內(nèi)的液體，加入標本洗滌液洗滌5次，于干凈的紙上拍干，除去殘留的液體，向每孔中加入酶聯(lián)物100μl，振蕩均勻，于370C，溫育30min。 10. 取出反應(yīng)的酶標板條，倒掉孔內(nèi)的液體，加入標本洗滌液洗滌5次，于干凈的紙上拍干，除去殘留的液體，向每孔中加入A、B底物各50μl，振蕩均勻，于370C，溫育10-15min。 10. 取出反應(yīng)的酶標板條，立即向每孔中加入50μl終止液，于5分鐘內(nèi)在450 nm處用酶標儀讀出吸光度。 結(jié)果判斷：以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐c標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。 M2-PK參考濃度:≤15U M2-PK/ml EDTA 血漿 參考濃度≤15U M2-PK/ml EDTA 血漿，對應(yīng)90%的參照組除腫瘤病還感染有其他疾病。 含量在15-20U/ml的數(shù)值為不確定的可疑血漿。 操作注意事項： 1． 所有的試劑和酶標板在使用之前均要平衡至室溫。 2． 使用前應(yīng)搖勻所有的液體試劑，但要防止瓶蓋上沾有試劑。 3． 操作時應(yīng)該按照相同的程序操作和相同的時間間隔。 4． 為了避免污染，使用干凈的加樣器吸管和干凈的容器，不要使用同一個容器來盛裝不同的試劑。 5． 每次洗滌時要倒置酶標板于干凈的紙巾上拍打，除去殘留液體，避免液體回濺，培養(yǎng)過程中的洗滌每次至少要1分鐘。 6． 加試劑和樣本之后應(yīng)振蕩酶標板以保證試劑的均勻分布，若有泡沫請用干凈的針除去。 7． 實驗操作過程中要注意安全，避免皮膚直接接觸標準品、質(zhì)控液，更不能用嘴吸液，要帶手套，不同批號的材料不要混用。 8． 操作完成要按照說明妥善保管好各種試劑。 注意： 1. 本試驗結(jié)果需結(jié)合臨床表現(xiàn)、病史及其他診斷結(jié)果方可采取適當臨床處理。 2. 2－8℃貯存,貯存至有效期結(jié)束；不同批號的試劑不能混用，標本稀釋液及酶聯(lián)物不能凍結(jié)。本試劑盒有效期九個月。
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