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張景然，岳中花，喬艷芬（博納艾杰爾應(yīng)用部）
1. 前言
香蘭素亦稱香草素、香草醛等，學(xué)名為3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，根據(jù)歐盟專家委員會(huì)2000年2月24日?qǐng)?bào)道，大劑量可導(dǎo)致頭痛，惡心，嘔吐，呼吸困難，甚至損傷肝腎功能。
| 樣品組分 | 結(jié)構(gòu)式 |
| 香蘭素 | |
中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760-2011）規(guī)定，較大嬰兒和幼兒配方食品中香蘭素zui大使用量為5mg/100mL，其中100mL以即食食品計(jì)，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按照沖調(diào)比例折算成配方食品中的使用量；嬰幼兒谷類輔助食品中可以使用香蘭素，zui大使用量為7mg/100g，其中100g以即食食品計(jì)；凡使用范圍涵蓋0至6個(gè)月嬰幼兒配方食品不得添加任何食用香料。
國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中只規(guī)定了限值，未有檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)使用天津博納艾杰爾科技有限公司的Cleanert® PAX固相萃取小柱和Venusil® XBP C18（L）液相色譜柱，建立了一種奶粉中香蘭素的檢測(cè)方法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度高。
2. 實(shí)驗(yàn)方法
2.1實(shí)驗(yàn)試劑和耗材
l 水 （pH=4.5）；取100mL水，用乙酸調(diào)節(jié)pH至4.5；
l 2%乙酸鉛溶液：稱取乙酸鉛2g，加水稀釋并定容至100mL；
l 5%氨水溶液：取氨水溶液5mL，加水稀釋并定容至100mL；
l 5%酸化甲醇：取甲酸5mL，加甲醇95mL混勻；
l 香蘭素儲(chǔ)備液 （1mg/mL）：準(zhǔn)確稱取香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，加水稀釋并定容至10mL；
l SPE柱：Cleanert® PAX （60mg/3mL），使用前分別用3mL甲醇和3mL水活化；
l HPLC柱：Venusil® XBP C18 （L） （5μm 150Å 4.6*150mm）；
l 針式過(guò)濾器：親水型 PTFE （0.45μm，13mm）。
2.2 儀器及設(shè)備
l LC-10F液相色譜系統(tǒng)；
l Qdaura®卓睿全自動(dòng)固相萃取儀；
l 高速離心機(jī) （轉(zhuǎn)子50mL*6）；
l 氮吹儀；
l 12位固相萃取裝置。
2.3試樣處理
準(zhǔn)確稱取奶粉試樣1g（至0.01g）于50mL離心管中，加入pH=4.5的水溶液5mL，混勻超聲提取5min，加2%乙酸鉛溶液2mL，混勻后靜置2min，8000r/min離心10min；取上清液用5%氨水溶液調(diào)節(jié)pH至中性；將上清液全部加樣至活化好的Cleanert® PAX小柱，然后分別用3mL 5%氨水溶液和3mL甲醇淋洗小柱，棄去淋洗液；用3mL 5%酸化甲醇洗脫（以上固相萃取操作通過(guò)Qdaura®卓睿全自動(dòng)固相萃取儀完成），收集洗脫液于30℃下氮?dú)獯蹈桑?/span>1mL流動(dòng)相重新溶解，過(guò)濾，待測(cè)。
2.4液相色譜條件
色譜柱：Venusil® XBP-C18（L），5um 150Å 4.6*150mm；
流動(dòng)相：A（0.02mol/L的磷酸二氫鉀溶液，磷酸調(diào)節(jié)pH=4.0）：B（乙腈）= 90：10；
流 速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μL；波 長(zhǎng)：276nm；柱溫：30℃。
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1線性關(guān)系和檢出限
量取一定量香蘭素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別用水稀釋至1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL和50μg/mL，按照3.3檢測(cè)條件依次進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，結(jié)果見表1：
表1 香蘭素標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限
| 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 | 相關(guān)系數(shù) | 檢出限（S/N>3） |
| Y=86.443X+36.907 | 0.9998 | 1μg/g |
3.2準(zhǔn)確度
表2. 5μg/g添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果
| | 平行1 | 平行2 | 平行3 | 平均回收率 | RSD |
| 回收率 | 89.03% | 94.30% | 90.67% | 91.33% | 2.70% |
表3. 25μg/g添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果
| | 平行1 | 平行2 | 平行3 | 平均回收率 | RSD |
| 回收率 | 85.08% | 87.85% | 83.59% | 85.51% | 2.16% |
4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)論
實(shí)驗(yàn)表明，Cleanert® PAX和Venusil® XBP C18（L）可以用于奶粉中香蘭素的檢測(cè)，本方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度高。
5. 實(shí)驗(yàn)圖譜
圖1 奶粉空白譜圖
圖2. 5μg/g添加譜圖
圖3. 1μg/g標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖
6. 訂貨信息
| 名稱 | 規(guī)格 | 訂貨號(hào) |
| 分析型液相色譜儀 | 10ml/min，等度系統(tǒng)，200-400nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)器 | FL-LC010 |
| 分析型色譜柱溫箱 | 室溫+5-50℃，箱內(nèi)兩對(duì)夾套 | CC-100-T |
| Qdaura® 卓睿全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng) | 4通道 | SPE-40 |
| 甲醇 | 色譜純，4*4L/箱 | AH230-4 |
| 乙腈 | 色譜純，4*4L/箱 | AH015-4 |
| Cleanert® PAX SPE柱 | 60mg/3ml，50支/盒 | AX0603 |
| Venusil® XBP C18（L）HPLC柱 | 5μm 150Å 4.6*150mm | VX952505-L |
| 保護(hù)柱芯 | 4.6*10mm，4/包 | VX950105-L |
| 保護(hù)柱套 | 適用于4.6*10mm的保護(hù)柱芯 | CH-100 |
| 親水PTFE針式過(guò)濾器 | 0.45μm，13mm，100/包 | AS081345 |
| 一次性注射器 | 2ml無(wú)針頭，100支/包 | LZSQ-2ML |
| 溶劑過(guò)濾器 | 1L | AM3100 |
| 1.5mL樣品瓶 | 短螺紋透明帶書寫處，100/PK | 1109-0519 |
| 1.5mL樣品瓶蓋 | 100/PK | 0915-1819 |
| 12樣品瓶 | 螺紋透明，100/PK | 1509-1657 |
| 12mL樣品瓶蓋 | 100/PK | 1515-1748 |
| 微孔濾膜（MCM） | 50mm，0.45μm，100片/包 | AM015045 |
| 微孔濾膜（Nylon） | 50mm，0.45μm，100片/包 | AM025045 |
| 離心機(jī) | zui大轉(zhuǎn)速10000r/min | TGL-10B |
| 氮吹儀 | 15位 | NV15-G |
| 真空固相萃取缸 | 12位 | VM12 |
| 流速調(diào)節(jié)閥 | 12個(gè)/包 | A81213 |
| 穿板導(dǎo)流針 | 12個(gè)/包 | A80100 |
| 無(wú)油隔膜真空泵 | 1臺(tái) | A01003 |
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