優化高電場強度電泳的實驗條件需要綜合考慮多個因素,以下是一些建議:
選擇合適的凝膠
凝膠類型:根據核酸或蛋白質的特性選擇合適的凝膠類型。例如,瓊脂糖凝膠適用于分離較大的核酸分子,而聚丙烯酰胺凝膠則更適合分離較小的核酸片段或蛋白質,其分辨率更高。
凝膠濃度:凝膠濃度影響分子的遷移速度和分離效果。對于核酸電泳,分離大片段 DNA 時可選用低濃度瓊脂糖凝膠(如 0.8% - 1.0%),而分離小片段 DNA 或 RNA 時則需要較高濃度的凝膠(如 1.5% - 3.0%)。對于蛋白質電泳,常用的聚丙烯酰胺凝膠濃度在 7.5% - 15% 之間,具體濃度取決于蛋白質的分子量大小。
優化緩沖液
緩沖液種類:不同的緩沖液具有不同的 pH 值和離子強度,會影響生物大分子的電荷狀態和遷移速度。例如,Tris - HCl 緩沖液常用于蛋白質電泳,而 TBE 或 TAE 緩沖液則廣泛應用于核酸電泳。TBE 緩沖液的緩沖能力較強,能更好地維持 pH 穩定,但成本相對較高;TAE 緩沖液的導電性較好,適用于快速電泳,但緩沖能力稍弱。
離子強度:緩沖液的離子強度要適中。離子強度過高會導致電流過大,產生過多熱量,甚至引起凝膠熔化;離子強度過低則會使電泳速度變慢,分離效果不佳。一般來說,核酸電泳中 TBE 或 TAE 緩沖液的工作濃度在 0.5× - 1× 之間,蛋白質電泳中常用的 Tris - HCl 緩沖液離子強度在 25 - 50 mmol/L 之間。
調整電場強度
確定最佳電壓范圍:在高電場強度電泳中,雖然較高的電壓可以縮短電泳時間,但過高的電壓會產生大量熱量,導致樣品擴散、凝膠變形等問題。因此,需要通過預實驗確定最佳的電壓范圍。一般來說,對于核酸電泳,電場強度可在 10 - 20 V/cm 之間進行嘗試;對于蛋白質電泳,電場強度通常在 15 - 30 V/cm 之間。
采用恒壓或恒流模式:根據實驗需求選擇合適的電泳模式。恒壓模式下,電壓保持恒定,隨著電泳的進行,電流會逐漸減小,適用于分離不同大小的生物大分子混合物;恒流模式下,電流保持不變,電壓會隨著電阻的變化而變化,適用于對電泳時間要求較為嚴格的實驗。
優化樣品處理
樣品濃度:樣品濃度過高會導致條帶拖尾或重疊,影響分離效果;樣品濃度過低則可能使條帶過于微弱,難以檢測。一般來說,核酸樣品的濃度在 50 - 500 ng/μL 之間較為合適,蛋白質樣品的濃度在 0.5 - 5 mg/mL 之間。
樣品緩沖液:在樣品中加入適量的樣品緩沖液,其作用是增加樣品的密度,使樣品能夠沉入加樣孔底部,同時還能提供一定的緩沖能力和顏色指示。樣品緩沖液中通常含有甘油、蔗糖等密度試劑,以及溴酚藍、二甲苯青等指示劑。
控制電泳溫度
選擇合適的電泳時間
預實驗確定時間:不同的生物大分子在不同的凝膠和電場條件下,所需的電泳時間不同。通過預實驗,觀察樣品在凝膠中的遷移情況,確定最佳的電泳時間。一般來說,核酸電泳時間在 30 分鐘至數小時不等,蛋白質電泳時間在 1 - 3 小時左右。
實時監測:在電泳過程中,可以通過觀察指示劑的遷移位置來判斷電泳的進度。當指示劑遷移到合適的位置時,即可停止電泳。例如,在核酸電泳中,溴酚藍通常遷移到凝膠的 2/3 處或接近底部時,電泳結束;在蛋白質電泳中,二甲苯青遷移到凝膠底部附近時,可停止電泳。