一、概念及應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，細(xì)胞轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。常用于研究基因功能、基因表達(dá)調(diào)控、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)中，其應(yīng)用非常廣泛。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

1、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但持續(xù)時(shí)間只有幾天（數(shù)天內(nèi)大部分外源性 DNA 會(huì)在核酸酶作用下降解或被細(xì)胞分裂稀釋，一周后便無(wú)法再檢出）。使用超螺旋質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的高，因?yàn)槠淠鼙患?xì)胞更高效地?cái)z取。

2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：外源性DNA可以整合至細(xì)胞基因組中，或者作為游離型質(zhì)粒存在，并可傳遞至轉(zhuǎn)染細(xì)胞的子代。但通常只有單個(gè)或幾個(gè)拷貝的外源性DNA整合至穩(wěn)定轉(zhuǎn)染基因組中，因此穩(wěn)定轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)水平一般低于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)水平。由于外源性DNA穩(wěn)定整合至基因組的概率很低，因此通常在用于轉(zhuǎn)染的DNA構(gòu)建體中納入可篩選標(biāo)記物（如對(duì)各種篩選藥物產(chǎn)生抗性的基因，或是可對(duì)待轉(zhuǎn)染細(xì)胞系有缺陷的必需基因進(jìn)行補(bǔ)償?shù)幕颍缓笤诙虝旱幕謴?fù)期后對(duì)細(xì)胞施加適當(dāng)?shù)暮Y選壓力。

二、轉(zhuǎn)染方式

1、化學(xué)方法：利用載體分子包被核酸使其呈現(xiàn)中性電荷或正電荷，如陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣共沉淀法等。

2、生物方法：利用基因工程病毒轉(zhuǎn)染非病毒基因到細(xì)胞中，如病毒感染。（此方法將在下一節(jié)詳細(xì)介紹）

3、物理方法：在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生一個(gè)瞬時(shí)的孔從而導(dǎo)入DNA，如電穿孔法。

三、常見的轉(zhuǎn)染方法的原理、特點(diǎn)及步驟

以下簡(jiǎn)單介紹目前實(shí)驗(yàn)室常用的兩種方法。

1、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過(guò)靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附，再通過(guò)融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，所以轉(zhuǎn)染時(shí)間一般不超過(guò)24小時(shí)。

（1）特點(diǎn)：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的優(yōu)點(diǎn)是能夠高效轉(zhuǎn)染許多細(xì)胞系，適用于高通量篩選，并能夠遞送任何大小的 DNA 以及 RNA 和蛋白。此外，該方法既可應(yīng)用于穩(wěn)定表達(dá)，也可應(yīng)用于瞬時(shí)表達(dá)，與其他化學(xué)方法不同的是，其可用于將 DNA 和 RNA 向動(dòng)物和人體內(nèi)轉(zhuǎn)移；缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率依賴于細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件，因此，需要對(duì)每種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染條件和轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行優(yōu)化。

（2）實(shí)驗(yàn)步驟：將DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和轉(zhuǎn)染試劑分別在不同的管中稀釋→將兩者混合形成混合物→將形成的混合物加入細(xì)胞中，脂質(zhì)體的正電荷有助于幫助復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜上→復(fù)合物經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞→檢測(cè)基因表達(dá)或沉默情況。

2、電穿孔法：利用電脈沖可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時(shí)的膜上小孔，同時(shí)細(xì)胞膜上電勢(shì)升高，驅(qū)使帶電荷的分子（如 DNA）以類似于電泳的方式經(jīng)臨時(shí)微孔穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無(wú)法轉(zhuǎn)入時(shí)建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下，高電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)殺死50%-70% 的細(xì)胞。為確保轉(zhuǎn)染成功，針對(duì)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化電轉(zhuǎn)參數(shù)是極為重要的。電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖形狀、脈沖施加次數(shù)、緩沖液組分等因素都會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。

（1）特點(diǎn)：與其他轉(zhuǎn)染方法相比，電轉(zhuǎn)染具有諸多優(yōu)勢(shì)，其中主要優(yōu)勢(shì)包括：適用于所有細(xì)胞類型的瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；在確定電轉(zhuǎn)染條件的情況下，能夠在短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)染大量細(xì)胞。電轉(zhuǎn)的主要缺點(diǎn)在于高電壓脈沖可引起大量細(xì)胞死亡，僅部分細(xì)胞膜可以成功修復(fù)，因此相比化學(xué)轉(zhuǎn)染方法，電轉(zhuǎn)染需要使用更多數(shù)量的細(xì)胞。

（2）實(shí)驗(yàn)步驟：利用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細(xì)胞→對(duì)含有核酸，緩沖液，細(xì)胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細(xì)胞膜上形成電勢(shì)差，誘導(dǎo)產(chǎn)生暫時(shí)的孔使核酸進(jìn)入細(xì)胞→將細(xì)胞返回到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，使其慢慢恢復(fù)→檢測(cè)基因表達(dá)或沉默情況。

四、影響轉(zhuǎn)染效率的因素及注意事項(xiàng)

轉(zhuǎn)染效率受到多種因素影響，主要因素有以下幾種：

1、轉(zhuǎn)染試劑：

不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前需要根據(jù)細(xì)胞特性選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑。可以通過(guò)已發(fā)表文獻(xiàn)和轉(zhuǎn)染試劑提供的已成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株來(lái)進(jìn)行選擇。

2、細(xì)胞狀態(tài)：

轉(zhuǎn)染前細(xì)胞活力和總體健康狀況是轉(zhuǎn)染產(chǎn)生變異性的重要來(lái)源。一般建議在轉(zhuǎn)染前至少24小時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以確保細(xì)胞在傳代后處于轉(zhuǎn)染的生理?xiàng)l件，細(xì)胞活力大于 90%。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是復(fù)蘇經(jīng)過(guò)幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。為確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性，一般選擇低細(xì)胞代次（<30，能確保基因型不變）。如果發(fā)現(xiàn)同一株細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率降低，可以嘗試重新復(fù)蘇細(xì)胞以恢復(fù)結(jié)果。此外，污染會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。

3、匯合度：

轉(zhuǎn)染時(shí)過(guò)高或者過(guò)低的細(xì)胞密度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達(dá)水平偏低。因此要根據(jù)具體的細(xì)胞類型、應(yīng)用和轉(zhuǎn)染技術(shù)，來(lái)優(yōu)化確定相應(yīng)的密度。如使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞一般達(dá)到 70%-90% 的匯合度，懸浮細(xì)胞達(dá)到 5 × 105 至 2 × 106 個(gè)細(xì)胞/mL 的密度，即可獲得良好的結(jié)果。但不同的轉(zhuǎn)染試劑，針對(duì)不同細(xì)胞系要求轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度各不相同，因此使用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化并建立一個(gè)穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等等。不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊矔?huì)影響轉(zhuǎn)染時(shí)的鋪板密度，比如研究細(xì)胞周期相關(guān)基因等表達(dá)周期長(zhǎng)的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑。

4、培養(yǎng)基：

不同的細(xì)胞或細(xì)胞類型都有非常特定的培養(yǎng)基、血清、補(bǔ)充劑要求，選擇細(xì)胞類型的培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染方法在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中起著非常重要的作用。一些細(xì)胞系和原代細(xì)胞可能需要特殊的包被材料（如多聚賴氨酸、膠原蛋白、纖連蛋白等）以附著于培養(yǎng)板并獲得的轉(zhuǎn)染結(jié)果。

可參考已發(fā)表文獻(xiàn)或細(xì)胞來(lái)源處獲得獲得針對(duì)特定細(xì)胞類型的合適培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染方法，如果沒(méi)有相關(guān)信息，則需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或篩選實(shí)驗(yàn)確定。

5、血清：

一般培養(yǎng)基中存在血清可增強(qiáng) DNA 轉(zhuǎn)染。但使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)，一些血清蛋白會(huì)干擾復(fù)合物的形成，因此應(yīng)在無(wú)血清條件下制備DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。當(dāng)使用 RNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，建議在無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染，以避免潛在的RNase污染。

6、抗生素：

一般用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基中可含抗生素。不過(guò)，由于陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑可增加細(xì)胞通透性，因此也可能增加遞送到細(xì)胞內(nèi)的抗生素量，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性以及較低的轉(zhuǎn)染效率。因此不建議在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入抗生素。可在轉(zhuǎn)染前鋪板細(xì)胞時(shí)，使用無(wú)抗生素的培養(yǎng)基。

對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不應(yīng)在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因?yàn)檫@些抗生素是 Gibco Geneticin 選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。在構(gòu)建穩(wěn)定的細(xì)胞系時(shí)，在轉(zhuǎn)染程序后預(yù)留 48-72 小時(shí)供細(xì)胞表達(dá)抗性基因，之后再加入選擇性抗生素。

7、轉(zhuǎn)染分子類型：

質(zhì)粒 DNA 是的轉(zhuǎn)染載體。質(zhì)粒 DNA 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（線性或超螺旋）和大小會(huì)影響轉(zhuǎn)染的效率，超螺旋質(zhì)粒 DNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的高。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中，相對(duì)于超螺旋 DNA，雖然使用線性 DNA 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的 DNA 攝取量較低，但 DNA 整合到宿主基因組中的效果更優(yōu)。雖然寡核苷酸、RNA、siRNA 和蛋白質(zhì)等其他大分子也可以轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，但在使用這些大分子時(shí)，需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。

五、總結(jié)

沒(méi)有一種方法適用于所有類型的細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，不同的方法在轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞毒性、對(duì)正常生理的影響、基因表達(dá)水平等方面均存在廣泛的差異。因此應(yīng)根據(jù)具體的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需求來(lái)選擇轉(zhuǎn)染方法，理想的方法應(yīng)具有高轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性、對(duì)正常生理的影響盡可能小、易于使用和高重復(fù)性。同時(shí)，應(yīng)根據(jù)該方法進(jìn)行各種轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，以建立一個(gè)穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)方案。

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