防腐劑在疫苗生產(chǎn)過程中主要用于抑制微生物生長，是一類重要物質(zhì)。目前除了硫柳汞外，在生物制品及醫(yī)藥防腐劑中還常見如苯酚、間甲酚、2-苯氧乙醇、羥苯甲酯。在《中國藥典》三部（2020 版）中，苯酚按照通則 3113 進(jìn)行檢測(cè)，使用滴定顯色法進(jìn)行測(cè)定，含量應(yīng)不高于 3.0g/L；間甲酚按照通則 3114 使用比色法進(jìn)行測(cè)定，含量不高于 2.5g/L；2 - 苯氧乙醇按照附錄2液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)為4.0-6.0mg/mL。

目前不同防腐劑使用不同的檢測(cè)方法，對(duì)于檢測(cè)機(jī)構(gòu)來說方法種類多且工作量大，而滴定法靈敏度及誤差較大，需要工作人員有一定的視覺靈敏度和長期操作經(jīng)驗(yàn)。目前亟需開發(fā)能同時(shí)快速用于生物制品中多種防腐劑的快速檢測(cè)方法。

液相色譜儀作為一種常見便捷的色譜分析系統(tǒng)，在含量分析監(jiān)測(cè)中廣泛使用。本文建立了一種采用液相色譜儀對(duì)生物制品中苯酚、間甲酚、2 - 苯氧乙醇、羥苯甲酯殘留量同時(shí)檢測(cè)的分析方法。樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白后直接進(jìn)樣分析，前處理簡單、分析速度快、靈敏度高，可供相關(guān)檢測(cè)人員參考。

1.1 儀器

本實(shí)驗(yàn)采用島津超高效液相色譜儀 LC-40，具體配置為：

系統(tǒng)控制器：CBM-40lite

脫氣機(jī)：DGU-20A

輸液泵：LC-40B XRX2

自動(dòng)進(jìn)樣器：SIL-40CXR

柱溫箱：CTO-40C

檢測(cè)器：SPD-40V

色譜工作站：LabSolutions Ver.5.99

1.2 分析條件

液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18，2.0μm，100mmx2.1mm；P/N：227-30001-04；

流動(dòng)相：A-水；B-乙腈

流速：0.4mL/min

柱溫：40℃

進(jìn)樣體積：5μL

檢測(cè)波長：220nm、270nm

洗脫方式：梯度洗脫，B相初始濃度為10%，時(shí)間程序見表 1。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

以75%乙腈水溶液配制苯酚、間甲酚、2-苯氧乙醇、羥苯甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液 (1000μg/mL)，同時(shí)逐級(jí)稀釋為 0.5、1、2、5、10、20、50μg/mL共6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，待測(cè)。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確取100μL樣品溶液，加入300μL乙腈，渦旋混勻，14000rpm離心5min，上機(jī)分析。

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性和分離度

按照 1.2 中分析條件測(cè)試對(duì)照品溶液，色譜圖如圖 1 所示。通過梯度洗脫方式，四種化合物分離度良好，且分離度均大于 3（詳見圖 2），滿足液相色譜中關(guān)于定量色譜分離度要求。

2.2 專屬性

取空白溶劑進(jìn)行測(cè)定，色譜圖如圖3所示。在 270nm（羥苯甲酯定量通道）和 220nm（苯酚、2-苯氧乙醇、間甲酚定量通道）波長下，對(duì)照品（0.5ppm）中四種物質(zhì)出峰位置處同空白溶劑色譜圖相比均無干擾，專屬性良好。

2.3 線性關(guān)系

按照1.3配制 6 個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照1.2中的分析條件進(jìn)行測(cè)定。羥苯甲酯以 270nm 作為定量通道，苯酚、間甲酚、2-苯氧乙醇以220nm作為定量通道，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限見表2。（請(qǐng)參考文末附件）

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

按照1.2分析條件，分別取0.5μg/mL、20μg/mL對(duì)照品溶液上機(jī)測(cè)試，并計(jì)算各化合物保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)，以評(píng)價(jià)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性。表3結(jié)果顯示，目標(biāo)物保留時(shí)間和峰面積的RSD分別在0.07%-0.12%和 0.05%-0.35%之間。精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.5 樣品檢測(cè)和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

使用本方法檢測(cè)了A群C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物原液樣品，在陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制為兩個(gè)不同濃度的加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度平行制備三份，按照1.4處理后上機(jī)分析，樣品檢測(cè)結(jié)果和加標(biāo)回收結(jié)果見表4。加標(biāo)回收率在96.80-101.30%之間，測(cè)試結(jié)果的RSD在0.05-0.28%之間，方法可靠。