Piezo1-mediated stellate cell activation causes pressure-induced pancreatic fibrosis in mice

Keywords: Fibrosis; Gastroenterology.

慢性胰腺炎是一種胰腺組織進行性炎癥性疾病，其特征是產(chǎn)生胰島素的 β 細胞纖維化和丟失。一旦胰腺纖維化發(fā)展，胰腺功能的恢復就會受到限制。盡管飲酒是慢性胰腺炎的主要原因，但基因突變和胰管阻塞是其他的促成因素。這些原因都會引起胰腺纖維化，從而導致組織瘢痕形成和胰管狹窄，這兩者都會導致胰管內(nèi)壓升高。因此，胰管內(nèi)壓力升高似乎會導致胰腺纖維化，而胰腺纖維化會進一步加劇胰腺壓力。

研究證明，胰腺腺泡細胞通過機械激活的離子通道 Piezo1 感知壓力。由剪切應力、膜拉伸或高壓引起的膜張力會打開 Piezo1 通道，允許陽離子內(nèi)流，主要是 Ca2+。過度的 Piezo1 激活會產(chǎn)生異常高濃度的細胞內(nèi)鈣（[Ca2+]i），這對細胞有有害影響。

胰腺纖維化是由活化的胰腺星狀細胞（PSCs）分泌的細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白沉積引起的。然而，力引發(fā)這些影響的機制尚不清楚。基于對導管阻塞導致胰腺纖維化的觀察，美國杜克大學醫(yī)學系團隊假設 PSCs 也對壓力敏感，并在研究中闡明了 PSCs 表達機械敏感的離子通道 Piezo1，而這是壓力誘導的胰腺纖維化的原因。研究成果發(fā)表于 JCI Insight 期刊題為“Piezo1-mediated stellate cell activation causes pressure-induced pancreatic fibrosis in mice”。

首先，通過結(jié)扎胰腺尾部區(qū)域建立一個臨床相關(guān)的阻塞性胰腺炎模型來評估胰腺內(nèi)壓力對纖維化的影響（圖1 A）。5 分鐘后尾部區(qū)域的胰腺壓力從 8.5 mmHg（未結(jié)扎壓力）增加到 22.7 mmHg（結(jié)扎壓力）（圖1 B）。胰管結(jié)扎（PDL）8 天后，在尾部區(qū)域觀察到明顯的胰腺纖維化，胰腺未結(jié)扎區(qū)域未受影響（圖1 D-G、J）。30 天后仍觀察到類似的結(jié)果（圖1 H、K），伴隨膠原蛋白大量沉積的是尾部區(qū)域的內(nèi)分泌和外分泌組織的受損（圖1 J、K）。這些數(shù)據(jù)表明，胰內(nèi)壓升高會導致胰腺纖維化。

導管阻塞誘導胰腺纖維化的證明提高了 PSCs 對壓力敏感的可能性。為了評估 Piezo1 在 PSCs 和胰腺纖維化中的潛在作用，在表達膠質(zhì)纖維狀酸性蛋白（GFAP）的星狀細胞中刪除了 Piezo1。結(jié)果表明，Piezo1GFAP-KO 小鼠免受部分導管結(jié)扎誘導的胰腺纖維化；相比之下，胰腺腺泡細胞中 Piezo1 選擇性缺失的小鼠（Piezo1aci-KO 小鼠）仍受到壓力誘導纖維化的影響（圖1 D-G）。同樣，導管結(jié)扎后 30 天，在 WT 中觀察到大量膠原蛋白沉積伴胰腺外分泌和內(nèi)分泌組織丟失，但在 Piezo1GFAP-KO 小鼠中未觀察到（圖1 H、K）。這些發(fā)現(xiàn)表明，導管結(jié)扎誘導的壓力通過激活星狀細胞來誘導胰腺纖維化，而不依賴于腺泡細胞介導的胰腺炎。

圖1    Piezo1GFAP-KO 小鼠免受胰管結(jié)扎誘導的纖維化的影響。

PSCs 在胰腺纖維化中會產(chǎn)生過多的 ECM 蛋白，因此實驗假設胰內(nèi)壓力增加會刺激 PSC ECM 產(chǎn)生。為了確定可能的機械受體表達，通過免疫染色在 PSCs 中鑒定了 Piezo1，并通過 [Ca2+]i 升高來證明響應其激動劑 Yoda1 的功能激活（圖2 A、B）。在 Piezo1 缺失的 PSCs 中不存在 Yoda1 刺激的 [Ca2+]i 增加（圖2 C、D），證實了 Yoda1 的作用對 Piezo1 具有特異性。GsMTx4 是一種 Piezo1 拮抗劑，可阻斷 Yoda1 誘導的鈣升高（圖2 E）。去除外源性鈣消除了 Yoda1 誘導的鈣內(nèi)流，替換鈣（2 mM）恢復了鈣流入，證明 Piezo1 介導的 PSCs 中 [Ca2+]i 的增加依賴于外源性鈣（圖2 F、G）。高劑量 Yoda1（25 μM）不影響 PSC 活力和膜完整性，但所有細胞都對鈣離子載體離子霉素有反應。與小鼠 PSCs 一樣，Piezo1 通道在人 PSCs 中表達，并且對 Yoda1 刺激后的 GsMTx4 阻斷敏感（圖2 H-J）。

剪切應力和壓力等機械力是 Piezo1 的生理激活劑。對 PSCs 來施加機械力，1 秒的壓力僅促使 [Ca2+]i 的瞬時上升。為了更長時間地施加機械力并避免細胞適應長時間的機械推動，使用流體剪切應力刺激。長時間的高流體剪切應力是一種類似于阻塞性胰腺炎期間高流體壓力的情況。為了確定剪切應力對人 PSCs 的影響，以 12 dyne/cm2 的幅度持續(xù) 1 分鐘，這產(chǎn)生了與 Yoda1（25 μM）類似的 [Ca2+]i 的持續(xù)增加。這些變化被 GsMTx4 阻止（圖2 K、L）。與高剪切力的影響相反，低剪切應力（4 dyne/cm2，持續(xù) 1 分鐘）或持續(xù)時間較短的高剪切應力（12 dyne/cm2，持續(xù) 5 秒）僅促使 [Ca2+]i 的瞬時上升（圖2 M-Q）。這些發(fā)現(xiàn)表明，機械力對 [Ca2+]i 的影響取決于力和時間。

圖2    Piezo1 在胰腺星狀細胞中的功能表達。

正常胰腺組織中星狀細胞為靜止狀態(tài)，靜態(tài)的胰腺星狀細胞內(nèi)含維生素A脂滴和 ECM 蛋白（如纖連蛋白和膠原蛋白）的低水平表達。激活后，PSCs 會丟失核周脂肪滴并產(chǎn)生過量的 ECM 蛋白。為了確定 Piezo1 是否具有將靜止 PSCs 轉(zhuǎn)化為活化表型的能力，將 Yoda1  應用于人 PSCs，發(fā)現(xiàn)在 24 小時內(nèi)，近 80% 的 PSCs 失去了核周脂肪滴并變得細長，平均細胞面積和最大直徑顯著增加；纖連蛋白、I 型膠原和 Piezo1 mRNA 水平也顯著升高。與人類 PSCs 一樣，Yoda1 將小鼠 PSCs 也轉(zhuǎn)化為活化表型。Yoda1 對纖維化的所有影響在 Piezo1 缺失的 PSCs 中被阻止，證實了它們對 Piezo1 依賴性。

進一步地，為了確定機械力是否通過 Piezo1 介導星狀細胞活化，研究了有和沒有 GsMTx4 下高流體剪切應力的影響。施加在人 PSCs 上的剪切應力（12 dyne/cm2，持續(xù) 10 分鐘）顯著減少了核周脂肪滴的數(shù)量（圖3 A、B）。Yoda1 增加了 Piezo1 的表達，這增加了反復暴露于機械力可能誘導 Piezo1 介導的纖維化反應的可能性。為了檢驗這一假設，以 24 小時的間隔施加兩次剪切應力（25 dyne/cm2，持續(xù) 10 分鐘），并在體外檢查星狀細胞活化和纖維化反應。重要的是，重復的剪切應力增加了人 PSCs 中纖連蛋白和 I 型膠原蛋白水平（圖3 C-F）。用 GsMTx4 處理減輕了剪切應力介導的病理變化（圖3），表明機械力通過 Piezo1 誘導星狀細胞活化并增加 ECM 蛋白合成。

圖3    流體剪切應力誘導體外星狀細胞活化和纖維化。

研究報道，Piezo1 下游信號激活胰腺腺泡細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）中的 TRPV4 通道。在此研究中，研究人員在小鼠和人 PSCs 中檢測到功能性 TRPV4 通道。TRPV4 激動劑 GSK1016790A 在靜止小鼠和人 PSCs 中使 [Ca2+]i 產(chǎn)生持續(xù)升高，并被 TRPV4 阻斷劑HC067047阻斷。

最后，為了確定 TRPV4 是否參與 PSCs 中 Piezo1 介導的 [Ca2+]i 變化，從 TRPV4-KO 小鼠中分離細胞。Yoda1 或長時間的高剪切應力（12 dyne/cm2，持續(xù) 1 分鐘），通常會導致 [Ca2+]i 持續(xù)升高，但在 TRPV4 缺失 PSCs 中僅導致短暫的鈣升高。TRPV4被通過PLA2-花生四烯酸（PLA2-AA）細胞色素P450環(huán)氧合酶依賴性途徑產(chǎn)生的5'-6'EET激活。為了確定 Piezo1 是否激活 PLA2-AA，使用分泌型和細胞質(zhì) PLA2 抑制劑 YM26734 和 AACOCF3，發(fā)現(xiàn)YM26734 和 AACOCF3 一起顯著抑制 WT 小鼠 PSCs 中 Yoda1 介導的 [Ca2+]i 持續(xù)升高。此外，GsMTx4 阻斷了高剪切應力（12 dyne/cm2，持續(xù) 1 分鐘）對 TRPV4 缺失 PSCs 中瞬時 [Ca2+]i 升高的影響，證實了最初的瞬時鈣內(nèi)流是由 Piezo1 引起的，而隨后的 TRPV4 通道開放是 [Ca2+]i 持續(xù)升高的原因。

在確定 Piezo1 激活產(chǎn)生的 [Ca2+]i 持續(xù)升高需要 TRPV4 開放后，研究人員認為 TRPV4 負責星狀細胞活化。為了測試這種可能性，用 Yoda1 處理從 TRPV4-KO 小鼠中分離的 PSCs。與 WT PSCs 相比，Yoda1 沒有激活 TRPV4-KO 小鼠的 PSCs，也沒有觀察到 PSC 激活參數(shù)（細胞形狀、核周脂肪滴豐度和 ECM 蛋白表達）的變化（圖4 A-I）。如果 Piezo1 的病理作用（高壓誘導的星狀細胞活化和纖維化）需要 TRPV4 通道，預計缺失 TRPV4 的小鼠將受到保護，免受壓力誘導的慢性胰腺炎和纖維化的影響。如圖4 J-M 所示，缺乏 TRPV4 通道的小鼠受到保護，免受 PDL 誘導的胰腺纖維化的影響。

圖4     TRPV4-KO 小鼠免受胰管結(jié)扎誘導的纖維化的影響。

圖5    圖形概要

總之，該研究表明，胰腺星狀細胞通過表達機械激活的離子通道 Piezo1 表現(xiàn)出壓力敏感性，并且 Piezo1 的激活會啟動纖維化反應。Piezo1 激活的病理后果的完整表現(xiàn)需要鈣觸發(fā)的 TRPV4 通道開放及其伴隨的鈣內(nèi)流。該研究觀察結(jié)果與實驗發(fā)現(xiàn)一起支持了一種通過阻斷 Piezo1 或 TRPV4 通道來預防或治療胰腺纖維化的可能策略。

參考文獻：Swain SM, Romac JM, Vigna SR, Liddle RA. Piezo1-mediated stellate cell activation causes pressure-induced pancreatic fibrosis in mice. JCI Insight. 2022 Apr 22;7(8):e158288. doi: 10.1172/jci.insight.158288. PMID: 35451372; PMCID: PMC9089793.

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