分子膠（Molecular Glue）是一類靶向蛋白降解（TPD）的小分子化合物，通過促進E3連接酶與新底物間的相互作用，觸發泛素-蛋白酶系統，精準誘導靶蛋白降解。與蛋白降解靶向嵌合體（PROTAC）技術相比，分子膠具有分子量小、成藥性高、脫靶效應低等優勢[1]。

目前，FDA批準的來那度胺和泊馬度胺等分子膠藥物，在抗腫瘤、免疫調節等領域療效顯著，惠及數百萬患者并創造數百億美元收入[2]。然而，分子膠研發仍面臨挑戰，如發現過程缺乏系統性篩選方法，靶點確認和機制研究耗資巨大，限制了其進一步發展。

圖1. 分子膠作用原理[1]

隨著高通量篩選技術的不斷發展，分子膠有望在生物驗證、靶點確認和機制研究領域取得更多突破性進展。HTRF/Lance和Alpha技術具有均相免洗、操作簡單高效、信號穩定、靈敏度高、適用于高通量檢測等優勢，已被廣泛用于潛在分子膠靶標和效應蛋白之間親和力的驗證。

Lance及Alpha技術在分子內二價膠親和力測定中的應用

BRD4在多種癌細胞中過表達, 在癌細胞的遷移、代謝和惡性發展中發揮重要作用。BRD4作為溴結構域和末端外結構域 (BET) 家族的成員，其特征在于具有兩個串聯溴結構域（BD1、BD2）。最近的一項描述了一種分子內二價膠的降解劑IBG1。IBG1能夠結合BRD4的兩個串聯溴結構域，并將BRD4結合到DCAF16（Cullin RING E3 泛素連接酶）上，從而誘導BRD4的降解。

為了在生化水平驗證IBG1與BRD4和DCAF16的結合結構域，Oliver等[3]使用Lance Anti-His-Eu、His-BRD4及Cy5標記的DCAF16測定三元復合物的形成，他們發現IBG1能增強BRD4Tandem*和DCAF16之間的相互作用，而非通過單一BD1或BD2結構域（圖2b,c）。

圖2. IBG1增強BRD4 Tandem結構域和DCAF16之間的相互作用[3]

* Tandem: BRD4包含兩個溴結構域（BD1 和 BD2）的構建體

*JQ1: BET 家族溴結構域抑制劑

隨后，他們使用biotinylated-JQ1*, SA-Donor beads, His-BRD4, Nickel Chelate Acceptor beads，構建AlphaLISA displacement實驗（圖2e），驗證IBG1競爭性結合BRD4的能力。

實驗發現三元復合物BRD4Tandem: IBG1: DCAF16的親和力顯著強于BRD4BD1: IBG1: DCAF16，進一步證實了兩個溴結構域對于復合物形成都是必需的。總之，Lance及Alpha的實驗確立了IBG1能夠增強BRD4和DCAF16的親和力，并且需要BRD4兩個溴結構域的存在。

HTRF技術在分子膠親和力測定中的應用

SMAD4是TGF-β通路的核心介質，在TGF-β的刺激下，SMAD4與SMAD3等形成復合物，將信號從細胞外傳遞至細胞核，調控基因表達。SMAD4R361H突變是多種腫瘤中的常見突變，會損害SMAD4和SMAD3之間的相互作用，從而阻斷TGF-β誘導的抗增殖信號傳導。

為了檢測Ro-31-8220和Go-6983對His-SMAD4/SMAD4 R361H和Flag-SMAD3的相互作用的影響，Cong Tang等[4]使用HTRF Anti-FLAG-Tb Donor及Anti-His-d2 Acceptor構建了靈敏且可擴展的高通量篩選平臺。Ro-31-8220和Go-6983被鑒定為分子膠，可誘導SMAD4 R361H/SMAD3的相互作用。

圖3. Ro-31-8220和Go-6983被鑒定為分子膠誘導SMAD4 R361H/SMAD3的相互作用[4]

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