在清潔驗(yàn)證程序開發(fā)過程中，關(guān)鍵目標(biāo)是工藝驗(yàn)證：通過分析數(shù)據(jù)證明該過程的每一步都能將產(chǎn)品和清潔劑殘留去除到預(yù)定的可接受水平。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）1993 年的指南要求任何驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)都必須 “具有科學(xué)依據(jù)” 。這些標(biāo)準(zhǔn)會(huì)因所采用的清潔程序類型（例如在線清潔（CIP）或離線清潔（COP）），以及清潔程序是在同一產(chǎn)品的不同批次之間進(jìn)行還是在更換產(chǎn)品類型時(shí)進(jìn)行而有所不同。了解用戶所測試的分析物和清潔劑殘留的類型（例如蛋白質(zhì)發(fā)酵液樣品和陽離子表面活性劑）也很重要。這些參數(shù)決定了驗(yàn)證程序的檢測方法。

TOC 分析正迅速成為清潔驗(yàn)證的優(yōu)選分析方法，原因如下：許多制藥公司都在采用基于全產(chǎn)品方法開發(fā)清潔驗(yàn)證方法，即確定是否存在任何殘留，而不考慮其來源（包括產(chǎn)品、清潔劑、化學(xué)品、溶劑、副產(chǎn)品、降解物和微生物污染物等）。這種方法與 TOC 分析配合良好，因?yàn)?TOC 分析能夠檢測分子結(jié)構(gòu)中含碳的任何 API 或清潔劑殘留。詹金斯（Jenkins）等人發(fā)現(xiàn) TOC 分析在清潔驗(yàn)證中的應(yīng)用得到了有力支持：“TOC 檢測限低、分析時(shí)間短、與其他方法相比成本較低，并且能夠檢測所有含碳?xì)埩粑?rdquo; 。通過對(duì)比 TOC 分析、高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法、分光光度法（UV）、酶聯(lián)免疫吸附測定法、電泳法、pH 值檢測、電導(dǎo)率檢測和目視分析法，他們發(fā)現(xiàn) TOC 分析的性能與 HPLC 和分光光度法相當(dāng)，甚至更優(yōu)。

越來越依賴 TOC 分析的其他原因還包括：

• 初始資金投入、運(yùn)行和維護(hù)成本相對(duì)較低

• 操作簡便

• 靈敏度高

• 難降解分析物的回收率高

• 干擾小

在開發(fā)階段，使用一種或多種能夠代表實(shí)際清潔驗(yàn)證過程中遇到的活性劑類型的模型化合物對(duì)分析技術(shù)進(jìn)行測試，以此展示該技術(shù)的穩(wěn)健性、準(zhǔn)確性和精密度。

牛血清白蛋白（BSA）是一種可以很好地模擬其他蛋白質(zhì)類、難氧化 API 的化合物。血清白蛋白是所有哺乳動(dòng)物血漿中常見的一種蛋白質(zhì)，也是最為人熟知且經(jīng)過深入研究的蛋白質(zhì)之一。通過核磁共振（HNMR）和 X 射線晶體學(xué)分析，BSA 大致呈心形，含有 607 個(gè)氨基酸殘基，分子量約為 66317.25 原子質(zhì)量單位（amu） 。BSA 本身作為活性劑在制藥行業(yè)中應(yīng)用廣泛，同時(shí)也是開發(fā)穩(wěn)健的清潔驗(yàn)證分析方法的理想模型化合物。蛋白質(zhì)很難被氧化，當(dāng)使用蛋白質(zhì)化合物作為測試劑開發(fā) TOC 檢測方法時(shí)，對(duì)于與其他活性劑和抗氧化性較弱的分析物相關(guān)的分析結(jié)果，人們可以給予高度信任。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖鞘褂?BSA 作為模型化合物，確定 TOC 分析儀的線性響應(yīng)范圍，以便開發(fā)清潔驗(yàn)證方法，應(yīng)用賽萊默旗下品牌 OI Analytical Aurora 1030W TOC 分析儀和 1088 自動(dòng)進(jìn)樣器（圖 1）。

實(shí)驗(yàn)使用的校準(zhǔn)曲線（圖 2）展示了 Aurora 1030W TOC 分析儀在較寬的碳濃度范圍內(nèi)進(jìn)行高精度校準(zhǔn)的能力。該儀器使用 KHP 進(jìn)行校準(zhǔn)，KHP 是一種廣泛使用且易于氧化的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。圖 2 中的校準(zhǔn)曲線由 PC 軟件生成，該軟件與 Aurora 1030W 配備的觸摸屏軟件相同。響應(yīng)因子表示儀器以每 1000 個(gè)面積計(jì)數(shù)中 μg C 為單位的響應(yīng)值。

圖 2：Aurora 1030W TOC分析儀的KHP校準(zhǔn)曲線

以確定 1030W TOC 分析儀對(duì) BSA 的線性響應(yīng)范圍為目標(biāo)。這一概念與儀器校準(zhǔn)類似，能夠揭示儀器對(duì) BSA 濃度呈線性響應(yīng)的工作范圍。測試結(jié)果在圖 3 中以每個(gè)樣品的 BSA 濃度與 TOC 分析儀的面積計(jì)數(shù)響應(yīng)值的關(guān)系圖呈現(xiàn)。數(shù)據(jù)顯示，Aurora 1030W 能夠分析濃度約為 0.5 - 20ppm 的 BSA。

圖3：BSA 濃度與 TOC 面積計(jì)數(shù)關(guān)系圖

作為一種難氧化的蛋白質(zhì)，BSA 在其他研究中顯示出回收率低和儀器響應(yīng)不佳的問題。但這些數(shù)據(jù)表明，加熱過硫酸鹽氧化技術(shù)能夠在較寬的工作范圍內(nèi)徹底消解 BSA 樣品中的碳，并實(shí)現(xiàn)完全回收。如果繪制的圖采用二階最佳擬合曲線，則表明儀器對(duì) BSA 的回收不完全。在這些情況下，數(shù)據(jù)通常代表分析儀消解 BSA 的穩(wěn)健性上限；隨著樣品濃度的增加，儀器響應(yīng)相對(duì)保持不變。

下表進(jìn)一步展示了 Aurora 1030W 在分析 BSA 等蛋白質(zhì)樣品時(shí)可達(dá)到的精密度和準(zhǔn)確度。在分析時(shí)，制備了已知濃度的 BSA 樣品。由此可以計(jì)算出理論碳濃度，并與測量得到的碳濃度進(jìn)行比較。根據(jù) BSA 的分子量 66317.25amu 和碳的質(zhì)量百分比 53.065%，可以通過以下公式將碳濃度與 BSA 濃度關(guān)聯(lián)起來：

數(shù)據(jù)顯示，加熱過硫酸鹽技術(shù)能夠以高精度（平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.5%）和高準(zhǔn)確度（平均回收率為 87%）分析 BSA 樣品。

在清潔驗(yàn)證中，確定碳的適當(dāng)回收率至關(guān)重要。為了準(zhǔn)確評(píng)估系統(tǒng)回收率，必須確定理論濃度與實(shí)際濃度的斜率。在圖 4 中，繪制了表 2 中測定的 BSA 回收率，并得出了斜率。

圖4：BSA碳回收

由于 BSA 中理論碳含量預(yù)期為 53.065%，我們可以根據(jù)以下公式計(jì)算實(shí)際碳含量：
理論濃度/直線斜率=實(shí)際濃度
對(duì)于 BSA，53.065/1.1317=46.8896%碳。

通過了解分析儀的回收率，就可以為未來測定未知樣品中 BSA 含量的實(shí)驗(yàn)確定合適的范圍。