LNPs作為一種有前景的核酸藥物和疫苗遞送系統，已廣泛應用于包括癌癥在內的多種疾病的治療中。mRNA疫苗能夠通過LNPs將編碼特定抗原的mRNA遞送至抗原呈遞細胞（APCs），如DCs，進而誘導強烈的抗癌免疫反應。然而，盡管LNPs在mRNA疫苗遞送中表現出色，但其在circRNA疫苗遞送中的應用仍需進一步探索。LNP的組成，包括可電離脂質、輔助脂質、膽固醇及其他成分，對疫苗的遞送效率和免疫效果具有重要影響。因此，本研究旨在系統評估不同LNP組成對circRNA疫苗遞送及T細胞應答的影響。
材料與方法
本研究使用了六種可電離脂質（SM-102、MC3、ALC-0315、CL1、cKK-E12、OF-C4-Deg-Lin）、三種輔助脂質（DSPC、DOPE、9A1P9）以及不同摩爾比的膽固醇和β-谷甾醇。此外，還使用了編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA（mRNA-fLuc）作為蛋白質表達研究的模型，以及兩種已驗證治療潛力的小circRNA疫苗（circRNA-SIINFEKL和circRNA-E7）用于T細胞應答研究。
結果與討論
2.1 LNP組成對體外轉染及蛋白質表達的影響：
在體外實驗中，我們系統地評估了不同LNP組成對DC2.4細胞的轉染效率和蛋白質表達的影響。首先，使用編碼螢火蟲熒光素酶（fLuc）的mRNA（mRNA-fLuc）作為模型，制備了包含六種不同可電離脂質（SM-102、MC3、ALC-0315、CL1、cKK-E12、OF-C4-Deg-Lin）的LNPs。結果表明，SM-102 LNP在DC2.4細胞中的轉染效果較好，顯著高于其他可電離脂質。在蛋白質表達方面，SM-102 LNP同樣表現出最佳性能，在所有測試濃度下（0.5、1、2 μg/mL mRNA）均誘導出較高的熒光素酶表達。進一步地，我們評估了三種輔助脂質（DSPC、DOPE、9A1P9）對轉染效率的影響。結果顯示，基于SM-102的可電離脂質，DOPE LNP在DC2.4細胞中的轉染效果較優，盡管DSPC和9A1P9 LNP之間的轉染效率差異不顯著。最后，我們研究了不同膽固醇和β-谷甾醇摩爾比對LNP轉染效率和蛋白質表達的影響。實驗發現，含有19%膽固醇和19.5% β-谷甾醇摩爾比的LNP（F3）在體外實驗中表現出最高的mRNA和circRNA轉染效率。然而，在蛋白質表達方面，雖然F3 LNP表現出較高的水平，但與其他配方相比差異并不顯著。Fig. 1. Physicochemical properties and the in vitro characterization of the six mRNA-fLuc-LNPs. Fig. 2. In vivo LN delivery of mRNA-fLuc by six different ionizable LNPs.2.2 LNP組成對體內遞送及T細胞應答的影響：
在體內實驗中，我們通過皮下注射的方式將mRNA-fLuc LNPs注入BALB/c小鼠的足墊，并評估其在引流淋巴結（PO LNs）中的遞送效率和蛋白質表達。IVIS生物發光成像結果顯示，SM-102和ALC-0315 LNP在注射后6小時和24小時均表現出最高的熒光素酶表達。這表明這兩種LNP配方在體內遞送mRNA方面具有顯著優勢。為了評估circRNA疫苗的免疫原性，我們將編碼SIINFEKL抗原的小circRNA（circRNA-SIINFEKL）加載到LNPs中，并皮下注射到C57BL/6小鼠體內。免疫后21天，通過流式細胞術分析外周血單核細胞（PBMCs）中的抗原特異性CD8+ T細胞比例。結果顯示，SM-102和ALC-0315 LNP誘導的SIINFEKL特異性CD8+ T細胞比例顯著高于其他配方。此外，我們還評估了不同膽固醇和β-谷甾醇摩爾比對circRNA疫苗誘導T細胞應答的影響。使用編碼HPV-16 E7抗原的小circRNA（circRNA-E7）進行實驗，結果顯示，F1（100%膽固醇）LNP誘導的E7特異性CD8+ T細胞比例最高，盡管F3（19%膽固醇和19.5% β-谷甾醇）LNP在體外實驗中表現出更高的轉染效率和蛋白質表。Fig. 3. Mouse CD8+ T study response elicited by circRNA-SIINFEKL loaded in LNPs with different ionizable lipids, respectively. Fig. 4. In vitro and in vivo protein expression by mRNA-fLuc and in vivo T cell response by circRNA-E7 delivered by LNPs with different sterol lipid ratios.2.3 LNP組成對免疫細胞亞群的影響：
為了進一步探究不同LNP配方對免疫細胞亞群的影響，我們使用編碼OVA抗原的circRNA（circRNA-OVA）進行實驗，并評估了其在引流淋巴結中不同免疫細胞亞群中的轉染效率和抗原表達。流式細胞術分析結果顯示，F1和F3 LNP在CD45+淋巴細胞和DCs中轉染效果較好，且F1 LNP能夠顯著上調MHC II表達，表明其增強DC成熟和抗原呈遞的能力。這些發現與之前的蛋白質表達和T細胞應答結果一致，進一步證實了F1 LNP在誘導強免疫應答方面的優勢。Fig. 5. Intracellular delivery and immune activation of immune cell subsets in mouse draining LNs upon s.c. injection of circRNA-OVA LNPs in mice.結論
本研究系統評估了不同LNP組成對circRNA疫苗遞送及T細胞應答的影響。結果表明，SM-102是可電離脂質中的標線標線較優，而膽固醇和β-谷甾醇的摩爾比對LNP的遞送效率和免疫效果具有重要影響。富含膽固醇的LNP（如F1）更適合于需要強免疫激活的應用，而摻入β-谷甾醇的LNP（如F3）則可能在減少促炎反應方面具有優勢。這些發現為設計LNP作為circRNA治療劑和疫苗的載體提供了重要思路。
未來研究方向
未來的研究應進一步探索LNP各成分之間的相互作用及其對LNP穩定性和遞送效率的影響。此外，還應評估不同LNP配方在預防和治療疾病中的實際效果，以優化circRNA疫苗的臨床應用。
參考文獻：Alshehry, Yasir, et al. "Investigation of the impact of lipid nanoparticle compositions on the delivery and T cell response of circRNA vaccine." Journal of Controlled Release (2025): 113617.
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