一、知識背景

顯影定影試劑盒是一個用于Western blotting后續(xù)壓片后的洗片試劑。本試劑盒中的顯影和定影試劑的配方特別適合于×光片的顯影定影。

二、顯影定影試劑盒使用方法

1、顯影液配制：顯影液試劑A倒入燒杯中，加入500-700ml約50℃水,玻棒拌至充分溶解，再加入顯影液試劑B,玻棒攪拌至充分溶解，然后加入顯影液試劑C，玻棒攪拌至充分溶解，最后加水定容至1000 ml，玻棒攪拌混勻即可，倒入避光容器(棕或黑色瓶)中，室溫避光保存。

2、定影液配制：把定影液試劑A和試劑B倒入燒杯中，加入700ml約60℃水,玻棒攪拌至充分溶解，待冷卻后加入定影液試劑C，玻棒攪拌混勻后加水定容至1000 ml，玻棒攪拌混勻即可，倒入避光容器(棕或黑色瓶)中，室溫避光保存。

3、顯影：把×光片浸沒在顯影液內(nèi)，顯影10秒至10分鐘。具體顯影時間視根據(jù)顯影情況而定，可以在紅燈下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)顯影的程度已經(jīng)達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，即可終止顯影。

4、水洗：在清水中沖洗干凈，以除去顯影液。

5、定影：浸沒在定影液內(nèi)，定影30秒至3分鐘。定影時間長一點，對定影的結(jié)果沒有明顯影響。

6、水洗：在清水中沖洗干凈,以充分洗去各種殘留溶液。

三、顯影定影試劑盒注意事項

1、ECL A液和B液在吸取過程中必須要更換吸頭,A液和B液相互污染后會逐漸失效。各溶液使用后,請蓋緊瓶蓋,特別是B液,含有氧化劑,容易被還原而失效。

2、如果目的蛋白條帶過曝,可以縮短曝光時間,或者減少樣品、一抗及二抗的用量。

3、如果熒光迅速淬滅,可能原因是目的條帶熒光過強,導(dǎo)致HRP迅速消耗ECL。

4、如果沒有發(fā)光信號,可能是目的蛋白表達(dá)很弱,可延長曝光時間。

5、金屬氧化物顆粒可能會造成膜上出現(xiàn)顆粒狀斑點,避免使用帶有銹跡的剪刀以及鑷子,建議使用塑料的平頭鑷子。

6、應(yīng)使用高質(zhì)量保鮮膜。質(zhì)量較差的保鮮膜可能會淬滅熒光或由于含有雜質(zhì)而污染印跡膜造成曝光背景值偏高。

7、避免將多張膜置于同一個洗膜盒內(nèi)洗膜,相互吸附或摩擦可能造成很深的背景。

8、(NaN3)能抑制HRP活性,若回收HRP標(biāo)記探針或者抗體應(yīng)避免使用NaN3,如必需使用勿超過0.01%。

9、本產(chǎn)品僅用于科學(xué)研究,不得用于臨床診斷,不得用于食品和藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。

10、為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

四、應(yīng)用

顯影定影試劑盒可以用于ADAM17和ACE2基因干預(yù)對糖尿病心臟重構(gòu)的影響及分子機制研究：

探討體外實驗中當(dāng)ADAM17和ACE2同時被抑制時心肌細(xì)胞自噬和凋亡的情況。

研究方法：1.動物實驗的分組小鼠經(jīng)過配繁后獲得ADAM17α-MHCKO小鼠,將同窩出生的Cre陰性小鼠(ADAM17fl/fl小鼠)用于動物實驗中的對照組。給予ADAM17fl/fl小鼠和ADAM17α-MHCKO小鼠尾靜脈注射心肌細(xì)胞特異性啟動子c驅(qū)動的特異性敲減ACE2的九型腺相關(guān)病毒(AAV9-c-shACE2)。動物實驗分為4個組:ADAM17fl/fl DM+Vector組、ADAM17α-MHCKO DM+Vector組、ADAM17fl/fl DM+AAV9-shACE2組、ADAM17α-MHCKO DM+AAV9-shACE2組。2.小動物超聲檢測小鼠心功能同論文Ⅰ部分3.小鼠組織標(biāo)本取材及病理檢查同論文Ⅰ部分4.新生大鼠原代心肌細(xì)胞(NRCMs)的提取選擇新出生的Wistar大鼠乳鼠(1d-3d)利用差速貼壁法提取原代心肌細(xì)胞。5.細(xì)胞實驗的分組按照實驗的設(shè)計,細(xì)胞實驗的分組情況如下:(1)Vehicle組;(2)GP組;(3)GP+NC-siRNA組;(4)GP+ADAM17-siRNA組;(5)GP+ACE2-siRNA組;(6)GP+ADAM17-siRNA+ACE2-siRNA組。6.Western Blot實驗對動物心臟組織和細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取后進(jìn)行SDS-凝膠電泳,經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗和二抗后進(jìn)行顯影定影試劑盒發(fā)光顯影。

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