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蛋白糖基化是一種主要的翻譯后修飾 (PTM)，糖鏈的分布和組成可影響療效和免疫原性。糖基化會受到許多不同因素的影響，并會發生一定程度的異質性。因此，糖基化被認為是必須控制以確保良好蛋白質質量的 CQA。
2025 年版《中國藥典》III 部新增了糖蛋白的糖基化分析等 5 個指導原則以及修訂了包括N糖譜測定法等近 20 個通則。這些新增指導原則與通則不斷提升標準的精確性與針對性，并補充了更精準的測定方法與分析技術，有力地確保了產品的質量和穩定性。
我們對糖基化分析指導原則（圖 1）和 N-糖譜測定法（表 1）更新總結如下：
表 1. 糖基化分析流程及方法
圖 1. N-糖譜分析通用方法
通過表 1，可以發現液相色譜/質譜 (LC/MS) 系統已廣泛用于分析完整蛋白和亞基水平，肽段水平，以及表征 PTM。
安捷倫為糖基化提供完整糖蛋白、糖肽、寡糖、單糖的全面分析（圖 2）。包括：
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前處理平臺
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Agilent 1290 Infinity III 液相色譜系統和 Agilent PLRP-S/AdvanceBio 專用色譜柱
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Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 系統和/或熒光檢測器 (FLD)
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合規的數據處理軟件
圖 2. 安捷倫糖型/糖鏈表征工作流程
安捷倫 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF
在蛋白糖基化表征中的應用案例分享
根據蛋白的復雜性、與藥物安全有效的相關性以及生產監控策略的總體設計等，安捷倫對不同水平的主要工作流程進行了相關研究。
Ⅰ.完整蛋白/亞基水平
在完整蛋白質水平表征 mAb 糖型，是快速評價和監控 mAb 糖基化最為常用的方法。以 NIST mAb 為例（圖 3），主要糖型均獲得了低至 ppm 級的誤差和出色的譜圖清晰度，同時可獲得主要糖型修飾的相對比例。其他較小的糖基化異質性（例如 GlcNAc 殘基缺失），也可輕松鑒定。
圖 3. 完整 NISTmAb 的質譜解卷積結果及主要糖型的相對定量（進樣量 0.5µg）
rhEPO（重組人促紅細胞生成素）是一種活性糖蛋白。由于其糖基化位點多，糖型結構復雜，一直被視為糖基化表征的難題。從圖 4 可以看出，完整的 rhEPO 分子量分布在 30KDa 左右，而其氨基酸序列的分子量僅不到 20KDa，因此糖含量高達 50% 以上。
圖 4. 重組人促紅細胞生成素的質譜解卷積結果
Ⅱ.亞基水平
使用 DTT 或 TECP，對蛋白進行還原，以便完全還原鏈間二硫鍵。使用 IdeS 酶對蛋白酶切后再還原，用 scFc 看糖型的類型和比例，亞基水平可以獲得比完整蛋白水平更豐富的糖型信息，也可以用做亞基的 MAM。
圖 5. Ideas 酶切 NIST mAb 還原后 scFc 解卷積結果
Ⅲ.糖肽水平
對于糖基化的位點研究，通常在肽段水平在進行。與 N-糖基化不同，O-糖基化往往會在同一條肽段上出現多個修飾位點，此種情況下使用優先斷裂糖苷鍵 CID（碰撞誘導碎裂）的碎片，很難判斷修飾位點。ECD（電子捕獲碎裂）碎裂技術是在 2015 年由 e-MSion 公司研發。該公司于 2023 年成為安捷倫的一分子。ECD 碎裂時，多電荷的肽段在碎裂時完整保留了糖苷鍵，碎裂效率高，碎片信息豐富，可以用于糖基化位點的修飾分析。使用 6545XT QTOF 的 ECD 技術，對融合蛋白依那西普（Enbrel）的 O-糖基化位點進行了確認，共鑒定到 12 個 O-糖基化位點，為 O-糖基化表征提供了技術依據（圖 6）。
圖 6. 依那西普肽段 SQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPK 第 4, 7, 11, 12, 15, 16 和 25 位的 S/T 7 個 Core1 糖基化修飾 ECD 碎片及位點修飾判斷的關鍵碎片 c2,c4,c8,c10,c11,c12,c15,c16,c17,c32 和 z7
Ⅳ.游離寡糖水平（以N-糖譜為例）
在游離寡糖水平可以獲得全面豐富的蛋白寡糖類型結構和含量信息。以游離N-糖分析為例，通過 Gly-X InstantPC 試劑盒，可以在 45min 內實現蛋白的酶切、標記到凈化。經過色譜分離后，進行 LC-FLD/MS 的定量/定性分析（圖 7）。配合 PCDL 數據庫，可以覆蓋常見單抗和融合蛋白的 N-糖種類，使用方便。
圖 7. InstantPC 標記的西妥昔單抗 N-糖的 LC/FLD 色譜圖 (A)；根據 MS 數據生成的提取化合物色譜圖表明熒光譜圖中有無法檢測到的聚糖峰 (B)
在游離寡糖水平的鑒別和定量工作中，含高唾液酸的糖蛋白藥物的寡糖結構更加復雜，因此 2025 版《中國藥典》開發了針對的通用方法（圖 1）。安捷倫基于此開發了一種含高唾液酸糖蛋白藥物的游離寡糖分析方法，使用陰離子交換色譜柱，為這類分子的 N-糖定量提供可重現的高通量解決方案。以康柏西普為例（圖 8），該方案穩定可靠，每個峰所帶的唾液酸數量均通過標準品定性，并獲得良好分離。
圖 8. InstantPC 標記的康柏西普樣品連續六次進樣的疊加色譜圖
Ⅴ.游離單糖水平（以唾液酸為例）
唾液酸會影響蛋白藥物的半衰期和免疫原性，因此有必要對糖蛋白中的唾液酸進行測定。色譜法可以實現不同種類唾液酸的分離，專屬性強，且具有更高的靈敏度，因此，2025 版《中國藥典》對唾液酸的色譜法進行了補充。安捷倫唾液酸分析與定量解決方案線性范圍寬，定量限和檢測限結果良好，可用于糖蛋白中唾液酸的測定（圖 9）。
圖 9. DMB 標記的 (A) Neu5Ac 質譜圖；(B) Neu5Gc 質譜圖；（C）西妥昔單抗的唾液酸 UHPLC 熒光譜圖；（D）Neu5Ac 和 Neu5Gc 校準曲線和 LOD 及 LOQ
安捷倫生物藥糖基化分析中的優勢
總結如下：
快速、完整的游離寡糖和單糖樣品前處理方案:
無需額外配備耗材，可快速完成樣品前處理。相比傳統的 2-AB 標記，專利的標記試劑 InstantPC 熒光強度和質譜響應高 10 倍以上。
色譜分離：
1290 Infinity III Bio 超高效液相色譜儀系統采用生物兼容性流路，減少了待分析物與管路表面的非特異性相互作用。同時，Infinity Lab Assist 技術可以使工作效率提升 > 20%。針對不同類型的糖蛋白糖基化分析特點，專用的色譜柱確保快速、穩定和可重現的色譜分離結果。
高靈敏度 QTOF：
AJS 離子源幫助更好的聚焦離子，提高離子化效率，從而提高質譜檢測的靈敏度。雙通道 ADC 檢測器保證了質譜測量的質量數和質譜響應的準確度。
BioConfirm的合規性軟件平臺：
專用 Fragile Swarm Tune 模式，只需勾選糖譜 PCDL 庫和標記物類型，即可進行糖譜的匹配。
參考文獻：
曹琰，趙雄，王曉娟等.2025 年版《中國藥典》三部增修訂概況[J].中國藥品標準,2025,26(1): 28-33. doi: 10.19778/j.chp.2025.01.005
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