植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長和營養狀況及產量水平。本實驗練習測定根系活力的方法，為植物營養研究提供依據。

氯化三苯基四氮唑（TTC）是標準氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲瓚，生成的三苯甲瓚比較穩定，不會被空氣中的氧自動氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗的氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標。

操作步驟：

建議正式實驗前選取2個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗樣本和試劑浪費！

1、預實驗樣本制備

將根部組織洗凈，去除根上的泥土，輕輕擦干，不要過分擠壓破壞根系細胞。

2、標準溶液的配制

① 臨用前取 10μL 10mg/mL TTC標準液，加入1990μL試劑二，充分混勻，配制成 50μg/mL TTC標準溶液，現用現配。（后續實驗需要1000μL，為減小實驗誤差，故配制大體積。）

② 取 1mL 50 μg/mL TTC 標準溶液加入到一支試劑三內，充分震蕩混勻2min。混勻后加入 1mL 乙酸乙酯，再次充分震蕩混勻2min，室溫靜置分層5min，取上層溶液。

③ 將上層溶液用乙酸乙酯進行稀釋，得到20μg/mL標準溶液備用（吸取200μL 50μg/mL TTC加入300μL乙酸乙酯混勻即可）。

3、預實驗上機操作：

① 酶標儀預熱30min以上，調節波長至485nm。

② 標準溶液的測定：取 200μL 20μg/mL標準溶液和200μL乙酸乙酯（即0μg/mL）于96孔板(非聚苯乙烯材質)中，分別測定其在485nm處的吸光度，分別記為A標準管、A空白管。計算ΔA標準= A標準管-A空白管。ΔA標準只需做1-2次。

③ 操作表：

4、正式實驗：

① 若樣品 37℃暗反應未到4h但根系已出現深粉色，此時可以直接進行下一步實驗操作；若ΔA測定大于1.5，可以減少樣本質量或者縮短反應時間進行實驗，計算公式注意修改；

② 若4h暗反應結束后，根系沒有出現粉色或者ΔA測定小于0.005，可以延長暗反應時間（8h，16h甚至24h）或者加大樣品量，計算公式注意修改。

③ 確定好最適實驗條件后，正式實驗樣本制備同預實驗樣本制備；

④ 正式實驗按照預實驗上機操作步驟進行（標準管和空白管預實驗已做，正式實驗可選做）。

五、結果計算：

按照樣本質量計算根系活力：以TTC的還原量來表示根系活力：

TTC還原強度[ μg TTC/(g·h)] =ΔA測定×C標÷ΔA標準×V÷(W×T)

=5×ΔA測定÷ΔA標準÷W

W：根重，g； C標：標準溶液濃度，20μg/mL；

T：反應時間，4h； V：試劑五的體積即勻漿體積，1mL。

注意事項：

1、試劑五容易揮發，有毒，為了您的健康，請穿實驗服，戴口罩，戴乳膠手套操作。

2、如果離心后待測的上清依然渾濁，可嘗試加大離心轉速或者延長時間，例如15000rpm 4℃離心 20min。